牛αsl-casein乳腺表達載體及金屬硫蛋白在轉基因小鼠乳腺中的表達.pdf

1、金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸、無芳香族氨基酸的低分子量蛋白，可分為四種亞型MT-Ⅲ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ、MT-Ⅳ，每分子MT可以結合7分子的Zn3+或Cd2+。對金屬離子與自由基具有很高親和力的特性使得MT在對金屬離子特別是Zn2+的代謝、運輸以及自由基的清除過程中發(fā)揮著重要作用，因此在商業(yè)和醫(yī)學領域有著廣泛的應用，但傳統(tǒng)制備方法效率低、成本高的局限性限制了MT的大規(guī)模應用，因此我們借助乳腺生物反應器技術以解決這種問題。
　　

2、首先，利用牛αs1酪蛋白的兩側序列-1660-1437，15628-19476作為MT的調控元件，1.3kb雞溶菌酶基因5’側翼序列和2個拷貝的雞β珠蛋白絕緣子作為去除位置效應的原件，三者通過組合得到三種結構的表達載體pIMC-MT、pIC-MT、pMC-MT。
　　 其次，采用限制性內切酶切割三個表達載體，并將得到的包含結構元件的片段通過原核顯微注射技術獲得轉基因鼠，在F0代鼠中經(jīng)PCR和SouthernBlot鑒定pIMC-

3、MT共有7只陽性鼠(公鼠3、14、16、20,母鼠22、24、29)，pIC-MT共有7只陽性鼠(公鼠2、7、8、10、13，母鼠21、27)，pMC-MT共有陽性鼠3只(公鼠6、12，母鼠20)。由于母鼠少，所以對陽性鼠傳代以擴大陽性母鼠數(shù)量。經(jīng)PCR鑒定F1代鼠中pIMC-MT共8只陽性母鼠(8、10、11、20、22、23、36、44)，pIC-MT共3只陽性母鼠(6、10、28)，pMC-MT共1只陽性母鼠(25)。
　　

4、 最后，對F0代和F1代母鼠分別采集乳汁，并對F1代采集乳腺組織進行Western blot、RT-PCR及Real-timePCR鑒定。在蛋白水平上所有轉基因鼠均未檢測到MT的表達，只在RNA水平上檢測到F1代小鼠中MT的表達，pIMC-MT轉基因鼠中只有11號有表達，pIC-MT及pMC-MT轉基因鼠中全部有表達。與GAPDH相比，GAPDH的表達量分別是pIMC-MT-F1-11的17.87、pIC-MT-F1-6的2.25、p