擬組織化培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞用于藥物的研究.pdf

1、體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞被廣泛用于藥物代謝、藥物間相互作用和藥物肝毒性的研究。傳統(tǒng)的單層貼壁培養(yǎng)不能長(zhǎng)期保持肝細(xì)胞功能和細(xì)胞色素酶活性，這些限制了它在藥物研究中的應(yīng)用。本論文將生物人工肝微型化，采用擬組織化的凝膠包埋大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)方式，從藥物代謝、藥物間相互作用和藥物肝毒性方面研究其可行性。為了使較難獲得的肝細(xì)胞充分應(yīng)用于研究中，肝細(xì)胞的低溫長(zhǎng)期保存非常重要。本實(shí)驗(yàn)還試圖尋找一種簡(jiǎn)單的方法低溫凍存新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞，并研究解凍后肝細(xì)胞的功

2、能。本論文主要分以下四部分： 第一部分研究了凝膠包埋培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞應(yīng)用于藥物代謝的可行性。實(shí)驗(yàn)以非那西丁、對(duì)硝基苯酚和7-羥基香豆素作為底物，研究了CYP1A2、CYP2E1和Ⅱ相酶(葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和硫酸轉(zhuǎn)移酶)的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞酶活性下降很快，凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞在7天內(nèi)能保持較高的Ⅰ相和Ⅱ相酶的活性，而且活細(xì)胞代謝酶活性比單層貼壁高1.5倍左右。以上結(jié)果表明凝膠包埋比單層貼壁培養(yǎng)能更好地保持藥物代謝酶的活性。

3、 第二部分評(píng)價(jià)了凝膠包埋培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞用于藥物間相互作用研究的可行性。實(shí)驗(yàn)以β-萘黃酮(50μmol/L)作為誘導(dǎo)劑，研究它對(duì)肝細(xì)胞CYP1A2、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和硫酸轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)β-萘黃酮誘導(dǎo)后，凝膠包埋和單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞CYP1A2的活性增強(qiáng)2.5倍左右，而Ⅱ相酶的活性增加并不明顯。另外，以二乙基二硫氨甲酸(5μmol/L)、西咪替丁(1mmol/L)作為抑制劑，研究它們對(duì)CYP2E1的抑制作用，發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑

4、對(duì)兩種培養(yǎng)模型的肝細(xì)胞都有明顯的抑制作用。上述結(jié)果顯示凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞適合用于藥物與藥物間相互作用的研究。 第三部分討論了凝膠包埋培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞用于藥物肝毒性研究的可行性。實(shí)驗(yàn)研究了水楊酸鈉(1，5mmol/L)對(duì)凝膠包埋和單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示水楊酸鈉對(duì)凝膠包埋和單層貼壁培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞同樣具有毒性作用。實(shí)驗(yàn)還用甲氨喋呤(1，5mmol/L)考察了凝膠包埋長(zhǎng)期培養(yǎng)毒性的研究，發(fā)現(xiàn)凝膠包埋對(duì)甲氨喋呤的毒性不

5、敏感。這可能是由于凝膠包埋能較好地保持酶活性和肝功能，增強(qiáng)了細(xì)胞的修復(fù)功能而導(dǎo)致毒性不明顯。 第四部分研究了大鼠肝細(xì)胞的冷凍方法及肝細(xì)胞解凍后的肝功能。實(shí)驗(yàn)采用泡沫材料使冷凍保存液緩慢降溫，采用此方法冷凍保存后的細(xì)胞活率下降15％左右。我們還測(cè)定了凍存后肝細(xì)胞的細(xì)胞色素酶、白蛋白分泌量以及對(duì)水楊酸鈉的毒性反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍存后CYP1A2和CYP2E1活性與新鮮分離的肝細(xì)胞沒(méi)有明顯差異，白蛋白分泌量為新鮮分離肝細(xì)胞的84％。凍存后