JBP485對(duì)刀豆球蛋白A導(dǎo)致的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的： 肝炎是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，以病毒性肝炎為最多見(jiàn)。近年來(lái)自身免疫性肝炎也越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注，這兩大類型肝炎的共同特征是免疫因素起主導(dǎo)作用，由于肝炎病毒蛋白在肝細(xì)胞表面的表達(dá)或自身抗體的出現(xiàn)，使淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別殺傷自身肝細(xì)胞。JBP485(Cyclo-trans-4-L-hydroxyprolyl-L-serine，環(huán)反式-4 左旋-羥脯氨酰絲氨酸)是從人胎盤水解產(chǎn)物L(fēng)aennec中提取出來(lái)的一種二肽，研究已證

2、實(shí)JBP485具有潛在的抗肝炎活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外方法研究JBP485的直接肝細(xì)胞保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為JBP485的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)及理論依據(jù)。 方法： 取雌性Wistar大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，構(gòu)建兩組體外肝細(xì)胞損傷模型及淋巴細(xì)胞增殖干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察JBP485對(duì)刀豆球蛋白A(Concanavalin A，Con A)導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用，同時(shí)觀察JBP485對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖是否具有抑制作用

3、。(1)模型Ⅰ：采用50μg/ml Con A直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。分為對(duì)照組、模型Ⅰ組、JBP485處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。25μM JBP485與肝細(xì)胞溫孵1小時(shí)后加入50 μg/ml Con A。(2)模型Ⅱ：20μg/ml Con A預(yù)處理的肝細(xì)胞與20 μg/ml Con A預(yù)刺激的自體脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)8小時(shí)。分為正常組、對(duì)照組、模型Ⅱ組、JBP485處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。25μM JBP485與肝細(xì)胞溫孵1小時(shí)后加入20

4、 μg/ml Con A作用24小時(shí)，脾淋巴細(xì)胞用Con A預(yù)刺激48小時(shí)，兩種細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)之前分別清洗兩次，JBP485以同樣的濃度出現(xiàn)在共培養(yǎng)體系中。對(duì)于兩個(gè)模型組，作用時(shí)間結(jié)束后收集培養(yǎng)上清液測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性及腫瘤壞死因子α(TNF-a)的含量；用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段分析；用RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)法分析caspase-3的表達(dá)情況。(3)ICAM-1誘導(dǎo)/抑制實(shí)驗(yàn)，把20μg/m

5、l Con A預(yù)刺激48小時(shí)的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到正常無(wú)血清培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，JBP485于脾細(xì)胞培養(yǎng)基加入前1小時(shí)加入肝細(xì)胞，用RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)法分析ICAM-1的表達(dá)情況。(4)用96孔板培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞，細(xì)胞密度1.5 × 106cells/ml，Con A終濃度5μg/ml，作用時(shí)間60小時(shí)。分為空白組(只加培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞)、陽(yáng)性對(duì)照組(5μg/ml Con A)、JBP485處理組，每組設(shè)

6、3個(gè)復(fù)孔。用MTT法測(cè)定各組OD值。 結(jié)果： (1)Con A對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生濃度依賴的直接細(xì)胞毒性作用； (2)JBP485能夠明顯抑制Con A直接導(dǎo)致的肝細(xì)胞毒性，與模型I比較，JBP485處理組的培養(yǎng)上清液中AST、LDH的活性明顯降低(p＜0.01：p＜0.05)，TNF-α的含量也減少(p＜0.01)； (3)JBP485能夠明顯抑制ConA預(yù)處理的肝細(xì)胞與Con A預(yù)刺激的自體脾淋巴細(xì)胞相互作用

7、產(chǎn)生的肝細(xì)胞毒性作用，與模型Ⅱ比較，JBP485處理組的培養(yǎng)上清液中．AST、LDH的活性明顯降低(p<0.01；p＜0.05)； (4)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示JBP485能夠抑制Con A．直接導(dǎo)致和肝、脾淋巴細(xì)胞相互作用而導(dǎo)致的肝細(xì)胞DNA的片斷化：RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，模型I組沒(méi)有明顯的easpase-3表達(dá)變化，而模型Ⅱ組easpase-3表達(dá)明顯增加，JBP485顯著抑制了easpase-3的表達(dá)(p＜0

8、.05；p＜0.05)； (5)RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示JBP485能夠明顯抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)(p＜0.05；p＜0.05)； (6)MTT結(jié)果顯示JBP485沒(méi)有明顯的抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用。 結(jié)論： (1)JBP485對(duì)Con A導(dǎo)致的細(xì)胞毒有直接的肝細(xì)胞保護(hù)作用； (2)JBP485能夠通過(guò)抑制Con A在體外引起的DNA片段化，抑制肝、脾淋巴細(xì)胞相互作用引起的肝