血管束、感覺神經(jīng)束植入構(gòu)建組織工程骨血管神經(jīng)化的早期形態(tài)學(xué)觀察.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染或腫瘤外科手術(shù)等病理性因素造成臨床出現(xiàn)大量骨缺損病例，所以大段節(jié)段性骨缺損的重建仍是一個(gè)重要的臨床問題。當(dāng)前臨床治療方法主要包括骨材料移植（自體移植，同種異體移植或異種移植）、不同生物材料植入或骨傳輸生長(zhǎng)方法（Ilizarov技術(shù)），但是這些技術(shù)均存在一定的缺陷和不足。 骨組織工程雖然在將來有可能取代自體骨移植，但目前必須解決如何同時(shí)為大塊骨支架材料內(nèi)細(xì)胞供應(yīng)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的問題。有效的血液循環(huán)和神經(jīng)支配對(duì)于骨組織的

2、生長(zhǎng)、發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)都具有重要的作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用各種不同方法促使所植入材料與宿主體內(nèi)各種支配因素（血管或神經(jīng)）結(jié)合將有助于解決這一問題。 本研究采用顯微外科方法將血管束、感覺神經(jīng)束植入組織工程骨修復(fù)大段骨缺損，觀察組織工程骨成骨及其血管化和神經(jīng)化，探討組織工程骨內(nèi)血液供應(yīng)和神經(jīng)支配的重建與成骨的關(guān)系，為其在臨床的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。 研究目的: 初步觀察血管束、感覺神經(jīng)束植入對(duì)組織工程骨內(nèi)血管神經(jīng)重建

3、的影響，探討血管束、感覺神經(jīng)束植入組織工程骨促成骨的可能機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.5～6月齡新西蘭大白兔42只，體重2.0～2.5kg，隨機(jī)分為3組，每組14只。從兔髂前上嵴穿刺抽取骨髓并分離獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，與帶側(cè)槽的β-磷酸三鈣（購自法國貝奧路公司）復(fù)合構(gòu)建組織工程骨；所有動(dòng)物均制造左側(cè)后肢股骨1.5cm大段節(jié)段性骨缺損，采用微型鋼板固定，按照骨缺損植入物不同進(jìn)行分組：A組，組織工程骨組，

4、單純植入組織工程骨；B組，血管束植入組，在植入組織工程骨的同時(shí)將股血管束游離適當(dāng)距離后植入組織工程骨側(cè)槽；C組，感覺神經(jīng)束植入組，在植入組織工程骨的同時(shí)將隱神經(jīng)游離適當(dāng)長(zhǎng)度后銳性切斷并植入組織工程骨的側(cè)槽。 2.影像學(xué)觀察及組織學(xué)觀察。術(shù)后4、8、12周每組分別取4只動(dòng)物，對(duì)骨缺損區(qū)行X線檢查后行影像學(xué)評(píng)分。處死動(dòng)物取標(biāo)本行4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)做5μm厚縱行切片，行HE及Masso

5、n染色，觀察組織工程骨成骨特點(diǎn)。 3.對(duì)各組標(biāo)本行CD34（血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物）的免疫組化染色。用圖像分析軟件（Image Pro-Plus6.0 Media Cybernetics，美國）測(cè)定染色陽性新生血管的數(shù)量。利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用3×3析因設(shè)計(jì)方差分析對(duì)處理因素和時(shí)間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)做統(tǒng)計(jì)，若有顯著性差異則用單向方差分析（One-way ANOVA）對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)各組間用LSD法行多重比較

6、分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.墨汁灌注觀察血管生成。術(shù)后12周各組取2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行墨汁灌注，制備冰凍切片觀察組織工程骨血管生成情況。 5.對(duì)各組標(biāo)本行突觸素（SY）及神經(jīng)微絲200（NF200）（神經(jīng)總標(biāo)記物）的免疫組化染色。用圖像分析軟件（Image Pro-Plus6.0 Media Cybernetics，美國）測(cè)定陽性染色的積分光密度值（IOD值）（IOD值與免疫表達(dá)強(qiáng)度成正比）。利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS1

7、3.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用3×3析因設(shè)計(jì)方差分析對(duì)處理因素和時(shí)間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)做統(tǒng)計(jì)，若有顯著性差異則用單向方差分析（One-way ANOVA）對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)各組間用LSD法行多重比較分析。 6.銀染色觀察支配神經(jīng)重建。取各時(shí)間點(diǎn)各組標(biāo)本行常規(guī)銀染色，觀察組織工程骨神經(jīng)重建情況。 結(jié)論: 1.在骨缺損修復(fù)早期，植入血管束的組織工程骨組與植入感覺神經(jīng)束的組織工程骨組均能促進(jìn)骨缺損修復(fù)，而兩組之間無明顯差別。

8、 2.在骨缺損修復(fù)早期，植入血管束的組織工程骨組與植入感覺神經(jīng)束的組織工程骨組均能促進(jìn)組織工程骨血液循環(huán)重建，而且前者重建效果優(yōu)于后者。 3.在骨缺損修復(fù)早期，植入血管束的組織工程骨組與植入感覺神經(jīng)束的組織工程骨組均能促進(jìn)組織工程骨支配神經(jīng)重建，而兩者之間總體無明顯差別。 4.新生血管與支配神經(jīng)在術(shù)后12周均出現(xiàn)不同程度減少，提示骨缺損修復(fù)初期（4～8周）在組織工程骨血管與神經(jīng)重建過程中具有重要意義。 5