食管鱗癌差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析.pdf

1、背景：2014年“世界癌癥報告”報道，中國每年食管癌(Esophageal Cancer, EC)新增和死亡病例居全球首位，其中90％組織學上屬于食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。近20年來，EC患者的總體五年生存率卻無顯著變化，仍徘徊于15%-25%。EC預后差的主要原因在于多數(shù)病人首次確診時已發(fā)展至中晚期，并且至少50%病人已有遠處轉移發(fā)生。因此，闡明ESCC發(fā)病因素

2、及發(fā)生發(fā)展的分子機制，篩選鑒定ESCC特異敏感的生物標志物，探索新的治療靶點和治療手段，對降低ESCC發(fā)病率及死亡率具有重要的理論意義及臨床應用價值。蛋白作為生命活動的最終承載者，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學功能。蛋白與蛋白通過多種方式相互作用而形成復雜的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡，參與正常生命活動的維系。病理狀態(tài)下，蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡也隨之發(fā)生動態(tài)變化。因此，單個蛋白的改變很難反映機體的生理或病理狀態(tài)，造成單個異常分子診斷疾病

3、的特異性、敏感性有限。質(zhì)譜、蛋白芯片及生物信息學技術的應用，使我們能夠從系統(tǒng)生物學角度理解生命及疾病過程的本質(zhì)。此外，基于質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)組學具有重復性差、樣品依賴度高和蛋白序列覆蓋率低等缺陷。因此，需要尋找另外的方法來彌補這些不足，并同時提高鑒定低豐度蛋白的可能性。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡分析不僅能夠提供蛋白質(zhì)分子功能、生物學通路及過程等信息，還能夠在一定程度上彌補蛋白質(zhì)組學研究的不足。
　　目的：⑴應用iTRAQ標記及質(zhì)譜定量技

4、術分析ESCC及癌旁形態(tài)學正常食管黏膜上皮組織差異表達蛋白譜；⑵對上述差異表達蛋白進行基因本體(Gene ontology, GO)富集分析，確定與腫瘤相關的種子蛋白并繪制種子蛋白與蛋白間相互作用網(wǎng)絡，通過網(wǎng)絡拓撲學結構分析確定關鍵節(jié)點/瓶頸蛋白，并對其進行KEGG通路富集分析；⑶確定ESCC候選標志物纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N1)、肌動蛋白結合蛋白(Transgelin，TAGLN)、整合素β1(Integrinβ1，

5、ITGB1)、14-3-3ζ(YWHAZ)在ESCC中的表達特征及臨床意義。
　　方法：①分別提取10例ESCC及癌旁組織(來源于林州市腫瘤醫(yī)院)蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取各例標本等量蛋白分別制備 ESCC和癌旁組織混合蛋白標本，并進行iTRAQ標記、質(zhì)譜定量分析ESCC相關蛋白表達(3次生物重復)；根據(jù)平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個確定差異表達蛋白列表；②應用BinGO對243個差異表達蛋白進行GO功能富集分析

6、，選取與腫瘤十大特征相關的117個蛋白為種子蛋白，搜尋STRING(http://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中構建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡；應用HUBBA網(wǎng)站(http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba/index.php)中“度(DEGREE)”和“瓶頸(BOTTLE NECK)”算法分析蛋白網(wǎng)絡的節(jié)點蛋白和瓶頸蛋白，并選取大于得分均值的蛋白為關鍵蛋白，ClueGO分析關鍵蛋白的KEGG通路特

7、征；根據(jù)癌蛋白緊臨及協(xié)同作用原則，由關鍵蛋白確定ESCC候選蛋白。③應用Western blot方法分析ESCC候選蛋白在ESCC組織中的表達：配制積層膠和分離膠，取等量癌與癌旁組織蛋白分別混合SDS上樣緩沖液進行蛋白電泳，經(jīng)轉印，牛奶封閉，孵育一抗，二抗，顯色曝光、顯影、定影，最終結果灰度分析定量分析表達差異。④采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，Western blot半定量結果分析采用配對t檢驗，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

8、　　結果：⑴本實驗最終鑒定了243個以平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個為判定標準的差異表達蛋白，包括ESCC中高表達蛋白119個和低表達蛋白125個；⑵2243個差異蛋白的GO富集分析結果表明：經(jīng)“超幾何檢驗”分析，“FDR”多重檢驗校正，顯著水平P<0.0001的GO條目有123個；與腫瘤十大特征(包括獨立信號系統(tǒng)；抑制生長信號降低；減少細胞死亡；無限分裂特性；促進血管發(fā)育；組織浸潤轉移；逃脫免疫監(jiān)視；促進炎癥形成；異常能量代謝；遺

9、傳物質(zhì)突變不穩(wěn)定)顯著相關的有17個GO條目，從而確定該條目包括的117個蛋白為種子蛋白；通過117個種子蛋白搜索STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡，該117個節(jié)點蛋白共包括255條相互作用；⑶網(wǎng)絡拓撲學分析該網(wǎng)絡各個節(jié)點的拓撲學評分，得到36個關鍵瓶頸蛋白和39個關鍵中心節(jié)點蛋白；上述關鍵蛋白整合經(jīng)KEGG通路分析表明該蛋白在11條通路顯示重要作用，分別為：黏著斑、蛋白酶體、細胞外基質(zhì)受體相互作用、肥厚型心肌病、擴張型心肌病

10、、致病性大腸桿菌感染、阿米巴病、白細胞跨內(nèi)皮遷移、心肌收縮、致心律失常性右室心肌病、補體和凝血級聯(lián)反應；與公認癌基因比對得到直接相互作用且拓撲學評分較高的蛋白作為候選蛋白，包括：Fibronectin、Transgelin、Integrinβ1、14-3-3ζ；⑷Western blot結果：ESCC中Fibronectin和Integrinβ1表達顯著升高，而Transgelin的表達卻明顯降低;14-3-3ζ在ESCC中的表達具有降