食管鱗癌差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析.pdf

1、背景：2014年“世界癌癥報告”報道，中國每年食管癌(Esophageal Cancer, EC)新增和死亡病例居全球首位，其中90％組織學(xué)上屬于食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。近20年來，EC患者的總體五年生存率卻無顯著變化，仍徘徊于15%-25%。EC預(yù)后差的主要原因在于多數(shù)病人首次確診時已發(fā)展至中晚期，并且至少50%病人已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生。因此，闡明ESCC發(fā)病因素

2、及發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，篩選鑒定ESCC特異敏感的生物標(biāo)志物，探索新的治療靶點(diǎn)和治療手段，對降低ESCC發(fā)病率及死亡率具有重要的理論意義及臨床應(yīng)用價值。蛋白作為生命活動的最終承載者，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能。蛋白與蛋白通過多種方式相互作用而形成復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，參與正常生命活動的維系。病理狀態(tài)下，蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)也隨之發(fā)生動態(tài)變化。因此，單個蛋白的改變很難反映機(jī)體的生理或病理狀態(tài)，造成單個異常分子診斷疾病

3、的特異性、敏感性有限。質(zhì)譜、蛋白芯片及生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使我們能夠從系統(tǒng)生物學(xué)角度理解生命及疾病過程的本質(zhì)。此外，基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)具有重復(fù)性差、樣品依賴度高和蛋白序列覆蓋率低等缺陷。因此，需要尋找另外的方法來彌補(bǔ)這些不足，并同時提高鑒定低豐度蛋白的可能性。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析不僅能夠提供蛋白質(zhì)分子功能、生物學(xué)通路及過程等信息，還能夠在一定程度上彌補(bǔ)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不足。
　　目的：⑴應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記及質(zhì)譜定量技

4、術(shù)分析ESCC及癌旁形態(tài)學(xué)正常食管黏膜上皮組織差異表達(dá)蛋白譜；⑵對上述差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體(Gene ontology, GO)富集分析，確定與腫瘤相關(guān)的種子蛋白并繪制種子蛋白與蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)/瓶頸蛋白，并對其進(jìn)行KEGG通路富集分析；⑶確定ESCC候選標(biāo)志物纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N1)、肌動蛋白結(jié)合蛋白(Transgelin，TAGLN)、整合素β1(Integrinβ1，

5、ITGB1)、14-3-3ζ(YWHAZ)在ESCC中的表達(dá)特征及臨床意義。
　　方法：①分別提取10例ESCC及癌旁組織(來源于林州市腫瘤醫(yī)院)蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取各例標(biāo)本等量蛋白分別制備 ESCC和癌旁組織混合蛋白標(biāo)本，并進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記、質(zhì)譜定量分析ESCC相關(guān)蛋白表達(dá)(3次生物重復(fù))；根據(jù)平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個確定差異表達(dá)蛋白列表；②應(yīng)用BinGO對243個差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析

6、，選取與腫瘤十大特征相關(guān)的117個蛋白為種子蛋白，搜尋STRING(http://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；應(yīng)用HUBBA網(wǎng)站(http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba/index.php)中“度(DEGREE)”和“瓶頸(BOTTLE NECK)”算法分析蛋白網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白和瓶頸蛋白，并選取大于得分均值的蛋白為關(guān)鍵蛋白，ClueGO分析關(guān)鍵蛋白的KEGG通路特

7、征；根據(jù)癌蛋白緊臨及協(xié)同作用原則，由關(guān)鍵蛋白確定ESCC候選蛋白。③應(yīng)用Western blot方法分析ESCC候選蛋白在ESCC組織中的表達(dá)：配制積層膠和分離膠，取等量癌與癌旁組織蛋白分別混合SDS上樣緩沖液進(jìn)行蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)印，牛奶封閉，孵育一抗，二抗，顯色曝光、顯影、定影，最終結(jié)果灰度分析定量分析表達(dá)差異。④采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，Western blot半定量結(jié)果分析采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

8、　　結(jié)果：⑴本實(shí)驗(yàn)最終鑒定了243個以平均差異倍數(shù)≥1.2倍及肽段≥2個為判定標(biāo)準(zhǔn)的差異表達(dá)蛋白，包括ESCC中高表達(dá)蛋白119個和低表達(dá)蛋白125個；⑵2243個差異蛋白的GO富集分析結(jié)果表明：經(jīng)“超幾何檢驗(yàn)”分析，“FDR”多重檢驗(yàn)校正，顯著水平P<0.0001的GO條目有123個；與腫瘤十大特征(包括獨(dú)立信號系統(tǒng)；抑制生長信號降低；減少細(xì)胞死亡；無限分裂特性；促進(jìn)血管發(fā)育；組織浸潤轉(zhuǎn)移；逃脫免疫監(jiān)視；促進(jìn)炎癥形成；異常能量代謝；遺

9、傳物質(zhì)突變不穩(wěn)定)顯著相關(guān)的有17個GO條目，從而確定該條目包括的117個蛋白為種子蛋白；通過117個種子蛋白搜索STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，該117個節(jié)點(diǎn)蛋白共包括255條相互作用；⑶網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析該網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)評分，得到36個關(guān)鍵瓶頸蛋白和39個關(guān)鍵中心節(jié)點(diǎn)蛋白；上述關(guān)鍵蛋白整合經(jīng)KEGG通路分析表明該蛋白在11條通路顯示重要作用，分別為：黏著斑、蛋白酶體、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病

10、、致病性大腸桿菌感染、阿米巴病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、心肌收縮、致心律失常性右室心肌病、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)；與公認(rèn)癌基因比對得到直接相互作用且拓?fù)鋵W(xué)評分較高的蛋白作為候選蛋白，包括：Fibronectin、Transgelin、Integrinβ1、14-3-3ζ；⑷Western blot結(jié)果：ESCC中Fibronectin和Integrinβ1表達(dá)顯著升高，而Transgelin的表達(dá)卻明顯降低;14-3-3ζ在ESCC中的表達(dá)具有降