“痰瘀同治”方藥對大鼠骨髓間充質干細胞增殖、凋亡、遷移及分泌VEGF的影響.pdf

1、近年來，隨著人們對組織工程及細胞治療領域關注度的提升，骨髓間充質干細胞(BMSCs)已成為研究的焦點之一。BMSCs是屬于骨髓來源的非造血干細胞，具有諸多生物學特性，如來源廣泛并易于分離擴增、低免疫源性且不易引起免疫損傷、作為“種子”細胞具有多向分化能力、可分泌多種細胞因子并通過自分泌或旁分泌功能影響自體或其他細胞多種生物學功能并可調節(jié)炎性反應等。BMSCs應用于心血管疾病已有大量的基礎及臨床研究報道。研究顯示，BMSCs可以增加梗死心

2、肌局部血流量及毛細血管密度，縮小梗死心肌面積，并在梗死心肌內發(fā)現(xiàn)了存活的移植細胞。也有實驗發(fā)現(xiàn)，BMSCs可被招募到損傷的血管部位并分化為內皮細胞及平滑肌細胞，同時對損傷血管進行修復。而BMSCs通過分泌細胞因子刺激血管新生、發(fā)揮抗炎作用、誘導其遷移至損傷組織并參與損傷組織的修復也有大量研究報道。
　　動脈粥樣硬化(AS)為多發(fā)病，其發(fā)生機制不清，可能與多因素、多發(fā)病環(huán)節(jié)密切相關。眾多學者認為，動脈粥樣硬化病變的發(fā)生是動脈對血管內

3、皮、內膜損傷做出的炎癥—纖維增生性反應。而BMSCs的生物學特性，使其為AS臨床應用提供可能性。
　　“痰瘀同治”方藥的主要成分為紅曲、瓜萎、薤白和三七，此前我們實驗小組已經對其進行了動物急性毒理實驗和對動脈粥樣硬化影響的實驗研究。結果表明，“痰瘀同治”方藥可以明顯降低血脂水平、穩(wěn)定斑塊，抑制動脈粥樣硬化的進展且安全無毒性作用。本實驗擬觀察“痰瘀同治”方藥對BMSCs增殖、凋亡、遷移等方面的影響，為“痰瘀同治”方藥與BMSCs聯(lián)合

4、應用治療AS提供理論基礎。
　　目的：
　　體外實驗觀察“痰瘀同治”方藥對大鼠BMSCs增殖、凋亡、遷移及分泌血管內皮生長因子(VEGF)的影響，并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機制。
　　方法：
　　取4周齡SD大鼠，分離其后肢脛骨和股骨，提取全骨髓細胞。采用全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)過程中應用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMSCs進行鑒定:對培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學觀察;流式細胞儀檢

5、測BMSCs表面標志物CD29、CD90，CD34、CD45陽性表達率;分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導BMSCs分化，并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細胞。用20mlDMSO將10mg“痰瘀同治”方藥完全溶解，完全培養(yǎng)基將其濃度稀釋為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L，并相應分為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L藥物組及對照組。用不同濃度“痰瘀同治”方藥與生長

6、良好的第3代BMSCs分別干預培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h，應用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測各組BMSCs的增殖情況，并篩選出最適藥物作用濃度及時間。應用流式細胞技術及transwell小室檢測不同藥物濃度在最適培養(yǎng)時間點時BMSCs的凋亡情況及BMSCs的遷移能力。在最適濃度及時間點干預培養(yǎng)第3代BMSCs，應用Western Blot檢測CXCR4蛋白的表達。ELISA法檢測不同干

7、預濃度培養(yǎng)的BMSCs在最適培養(yǎng)時間VEGF分泌水平。
　　結果：
　　1.大鼠BMSCs的形態(tài)學觀察及鑒定全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)14～21日即可傳代，傳代后增殖速度較原代明顯增快，7d左右可融合達80％。第3至第6代細胞純化程度高，細胞增殖能力強;傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形，細胞數(shù)目多、排列緊密時可呈漩渦狀排列。經流式細胞儀檢測，培養(yǎng)的BMSCs均一表達CD29、CD90，陽性率分別為98.23％

8、、98.69％;而CD34、CD45，陽性表達率分別為2.47％、1.94％;成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs后，觀察到脂滴被紅染的細胞;成骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs后，可見紅色礦化結節(jié)。上述結果均符合BMSCs的鑒定特征。
　　2.“痰瘀同治”方藥對BMSCs增殖及凋亡的影響以不同濃度“痰瘀同治”方藥與BMSCs共培養(yǎng)后，根據(jù)不同時間點測定的OD值繪制增殖曲線。與對照組曲線比較，曲線上藥物濃度為10ug/L、25ug/L及5

9、0ug/L有增殖效果，曲線下藥物濃度為100ug/L及150ug/L組抑制增殖。在藥物濃度為50ug/L而培養(yǎng)時間為24h、36h、48h、60h、72h，25ug/L培養(yǎng)時間在48h、60h、72h，10ug/L培養(yǎng)時間在60h、72h時，細胞生存率均明顯高于同時間點對照組，其差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;而50ug/L藥物組自36h后各時間點細胞生存率均顯著高于同時間點的10ug/L和25ug/L藥物濃度組，差異有統(tǒng)計學意義，P

10、＜0.05。經流式細胞儀檢測，當“痰瘀同治”方藥內容物溶解液與BMSCs共培養(yǎng)48h后，藥物濃度為25μg/L、50μg/L時對BMSCs凋亡有顯著抑制作用，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　3.“痰瘀同治”方藥對BMSCs遷移的影響“痰瘀同治”方藥藥物濃度10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L干預培養(yǎng)BMSCs48h，與對照組比較，各濃度藥物組遷移細胞數(shù)目均明顯多于對照組(P＜0.05)，其中

11、藥物濃度為50μg/L時對BMSCs的遷移促進作用最為顯著。Western blot結果顯示，各實驗組CXCR4蛋白表達均有少量的增加，與對照組比較，50μg/L藥物干預組CXCR4蛋白表達量增高明顯，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　4.“痰瘀同治”方藥對BMSCs分泌VEGF的影響當“痰瘀同治”方藥濃度為25μg/L、50μg/L，培養(yǎng)時間為48h時，BMSCs培養(yǎng)上清液中VEGF濃度分別為（406.22±10.71）pg