miR-181a抑制人紅白血病K562細胞生長機制的研究.pdf

1、微RNA是一類由基因組編碼的長約19-25個核苷酸的小分子、單鏈RNA，它們通常是由長約60-100個核苷酸，并帶有發(fā)夾結構的微RNA前體剪切而來。近年來的研究已經(jīng)證明，微RNA通常是作為基因表達的負性調控因子而發(fā)揮其功能，它們在各種發(fā)育和生理過程中發(fā)揮著重要的作用。微RNA可以引起mRNA的降解(與靶基因mRNA完全互補)或者抑制mRNA的翻譯(與靶基因mRNA不完全互補)。然而，在動物體內，微RNA與mRNA的3′非編碼區(qū)序列發(fā)生不

2、完全互補，并通過一種未知的機制削弱蛋白質的翻譯?，F(xiàn)在已知的微RNA，它們可以通過抑制翻譯但不影響靶基因mRNA的濃度，或者是直接誘導靶基因mRNA降解的方式，進而抑制靶基因mRNA的表達。 迄今為止，在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量微RNA，而其中一些微RNA在造血過程和造血系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中起了一定的作用?，F(xiàn)有的一些資料提示，人類白血病的發(fā)生可能與微RNA有關。miR-181a是小鼠骨髓細胞中特異表達的一類微RNA，當它在造血干細胞或祖

3、細胞中表達時可以促進B細胞的分化。已有研究證實，通過反義抑制肺癌細胞株A549細胞中miR-181a的表達，促進了細胞的增殖，提示miR-181a可能與腫瘤細胞的增殖密切相關。與未經(jīng)誘導的人白血病HL-60細胞相比，佛波酯誘導下向單核或巨噬樣細胞分化的HL-60細胞內，miR-181a的表達發(fā)生下調，提示miR-181a可能與白血病發(fā)生密切相關，但其具體的作用機制仍不清楚。綜上所述，這些結果提示miR-181a可能是一個與造血調控及血液

4、系統(tǒng)疾病發(fā)生相關的重要調控因素。 為進一步闡明miR-181a的作用機制，探討其對于白血病細胞生長及轉錄水平的影響，我們將化學合成的miR-181aduplex轉染進入人白血病K562細胞，并采用寡核苷酸芯片技術從全基因組水平上研究了K562細胞基因表達譜的變化。 首先，基于siRNAduplex在形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)過程中的不對稱性的特點，我們初

5、步設計了針對實驗研究所需的miR-181aRNAduplex。采用生物學軟件Oligo6.0評價其熱動力學特性，并通過改變反義鏈3'端個別堿基序列使其滿足熱動力學的需求，從而確定最終的設計序列。結果顯示，利用RISC形成過程的不對稱性，結合生物學軟件Oligo6.0的熱動力學分析來設計miRNARNAduplex，是一種簡便可行、有效的方法。 其次，我們利用Oligofectamine脂質體法將化學合成的miR-181adupl

6、ex轉染人紅白血病K562細胞，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法和臺盼藍拒染法檢測其對K562生長抑制的作用。MTT法檢測24，48，72h的細胞生長抑制率分別為(30.67±6.24)％，(47.95±3.55)％，(51.56±4.11)％；而臺盼藍拒染法檢測各時間點細胞生長抑制率分別為(29.71±2.68)％，(49.21±5.14)％，(55.31±4.29)％。結果采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析顯示，兩種方法計算的細胞

7、生長抑制率無顯著性差異(P=0.515)；MTT法和臺盼藍拒染法在24h測得的細胞生長抑制率與48、72h相比，差異均有顯著性(P＜0.01)，而48h與72h相比，細胞生長抑制率無顯著性差異(P＞0.05)。瑞氏-吉姆薩染色顯示，轉染組細胞表現(xiàn)出明顯的生長抑制的變化。上述證據(jù)表明，轉染miR-181a進入K562細胞會抑制白血病細胞的生長。 最后，我們應用基因芯片技術及系統(tǒng)分析的方法來研究微RNA對人白血病K562細胞基因表達

8、譜的影響，以闡明miR-181a可能的調控機制。轉染實驗采用Oligofectamine脂質體法。轉染后48h，應用AgilentHuman1A寡核苷酸基因芯片檢測和分析對照組與微RNA轉染組K562細胞間的基因表達譜差異。從20000個左右的候選基因中，篩選出228個差異表達基因。與對照組K562細胞比較，表達下調的有169個，主要有原癌基因、DNA結合與轉錄因子、代謝相關基因、信號轉導相關基因、細胞周期及發(fā)育相關基因等；表達上調的基

9、因有59個，主要有抑癌基因、代謝相關基因、信號轉導相關基因、免疫防御相關基因等。半定量RT-PCR驗證了CTCF、ZAP70、VAMP1、CNOT4、SEMA4C和RALA6個基因表達的變化。可見，微RNA轉染K562細胞后，通過抑制其靶基因的表達，進而引起了細胞內一系列基因的表達變化。這些基因可能與微RNA的功能相關，同時也是其在轉錄后水平上抑制基因表達的調控方式實現(xiàn)的基礎。這為進一步深入研究微RNA的功能及其具體的作用機制提供了重要

10、的線索和依據(jù)。 綜上所述，我們采用寡核苷酸芯片技術發(fā)現(xiàn)了一系列受miR-181a表達調控的基因。差異基因的改變中包括了原癌基因的表達下調和抑癌基因的表達上調，這可能在腫瘤發(fā)生及其分子水平的改變中具有重要的作用。原癌基因的激活和抑癌基因的損傷是腫瘤破壞正常細胞周期的兩種方式。因此，我們猜想這些基因的異常改變使得K562細胞的生長受到了抑制。此外，本研究也為脊椎動物微RNA具有多個靶基因，涉及基因調控的多個方面的假說提供了重要的實驗