苦參堿對人白血病K562細胞表觀遺傳因素影響的機制研究.pdf

1、苦參堿是中藥苦參的主要成分之一,我們前期研究發(fā)現(xiàn)苦參堿誘導了人白血病K562細胞分化和凋亡,但是分子機制尚不清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要機制之一,在腫瘤的基因異常表達起著重要作用。文獻報道RIZ1基因是一種抑癌基因,在K562細胞中由于RIZ1基因啟動子高甲基化導致其表達低下。在本論文中我們分別采用RT-PCR和甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)研究了苦參堿作用K562細胞后,其RIZ1基因mRNA表達水平和RIZ1基因啟動子甲基

2、化情況。同時我們還運用毛細管電泳(HPCE)、高效液相(HPLC)和甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(MS-RE)技術(shù)檢測了苦參堿對K562細胞基因組整體甲基化的影響。此外,利用RT-PCR技術(shù)還測定了RIZ1下游基因IGF-1 mRNA水平的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過實驗發(fā)現(xiàn)RIZ1基因的mRNA在對照組K562細胞低表達,經(jīng)苦參堿和苦參提取液作用K562細胞后,RIZ1mRNA水平表達明顯升高,并呈時間依賴性;同樣,5

3、-Aza CdR作用K562細胞后,RIZ1mRNA水平表達也明顯增高。
　　2.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞后,RIZ1基因啟動子發(fā)生去甲基化。
　　3.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3B mRNA表達無明顯變化。
　　4. HPCE、HPLC法檢測K562細胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞后基因組整體甲基化

4、水平較處理前稍降低。
　　5.用酶切法檢測K562細胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞前后對基因組整體甲基化水平無明顯影響。
　　6.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞前后IGF-1 mRNA表達無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1. K562細胞抑癌基因RIZ1啟動子是處于高甲基化狀態(tài),導致該基因低表達?？鄥A和苦參提取液作用K562細胞后,RIZ1mRNA水平表達明顯升

5、高,說明苦參堿抗白血病作用與誘導抑癌基因 RIZ1表達有關(guān)?？鄥A誘導 K562細胞抑癌基因 RIZ1上調(diào)與中藥苦參提取液作用一致,提示苦參堿是苦參抗腫瘤作用的主要活性成分。
　　2.實驗結(jié)果顯示苦參堿、苦參提取液和5-Aza CdR處理K562細胞后RIZ1啟動子發(fā)生去甲基化,提示RIZ1基因被誘導表達上調(diào)是RIZ1基因啟動子去甲基化作用所致。
　　3.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細胞前后DNMT1

6、mRNA、DNMT3B mRNA表達無明顯變化,說明苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR未通過調(diào)控DNMTsmRNA轉(zhuǎn)錄水平而誘導DNA去甲基化。
　　4. HPCE、HPLC法檢測K562細胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理后基因組整體甲基化水平較處理前稍降低,而用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法檢測K562細胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理前后對基因組整體甲基化水平無明顯影響,綜合說明苦參堿、苦參提取液對