苦參堿對(duì)人白血病K562細(xì)胞表觀遺傳因素影響的機(jī)制研究.pdf

1、苦參堿是中藥苦參的主要成分之一,我們前期研究發(fā)現(xiàn)苦參堿誘導(dǎo)了人白血病K562細(xì)胞分化和凋亡,但是分子機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一,在腫瘤的基因異常表達(dá)起著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道RIZ1基因是一種抑癌基因,在K562細(xì)胞中由于RIZ1基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)低下。在本論文中我們分別采用RT-PCR和甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)研究了苦參堿作用K562細(xì)胞后,其RIZ1基因mRNA表達(dá)水平和RIZ1基因啟動(dòng)子甲基

2、化情況。同時(shí)我們還運(yùn)用毛細(xì)管電泳(HPCE)、高效液相(HPLC)和甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(MS-RE)技術(shù)檢測(cè)了苦參堿對(duì)K562細(xì)胞基因組整體甲基化的影響。此外,利用RT-PCR技術(shù)還測(cè)定了RIZ1下游基因IGF-1 mRNA水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIZ1基因的mRNA在對(duì)照組K562細(xì)胞低表達(dá),經(jīng)苦參堿和苦參提取液作用K562細(xì)胞后,RIZ1mRNA水平表達(dá)明顯升高,并呈時(shí)間依賴性;同樣,5

3、-Aza CdR作用K562細(xì)胞后,RIZ1mRNA水平表達(dá)也明顯增高。
　　2.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞后,RIZ1基因啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化。
　　3.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3B mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　4. HPCE、HPLC法檢測(cè)K562細(xì)胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞后基因組整體甲基化

4、水平較處理前稍降低。
　　5.用酶切法檢測(cè)K562細(xì)胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞前后對(duì)基因組整體甲基化水平無(wú)明顯影響。
　　6.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞前后IGF-1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1. K562細(xì)胞抑癌基因RIZ1啟動(dòng)子是處于高甲基化狀態(tài),導(dǎo)致該基因低表達(dá)?？鄥A和苦參提取液作用K562細(xì)胞后,RIZ1mRNA水平表達(dá)明顯升

5、高,說(shuō)明苦參堿抗白血病作用與誘導(dǎo)抑癌基因 RIZ1表達(dá)有關(guān)?？鄥A誘導(dǎo) K562細(xì)胞抑癌基因 RIZ1上調(diào)與中藥苦參提取液作用一致,提示苦參堿是苦參抗腫瘤作用的主要活性成分。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苦參堿、苦參提取液和5-Aza CdR處理K562細(xì)胞后RIZ1啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化,提示RIZ1基因被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)是RIZ1基因啟動(dòng)子去甲基化作用所致。
　　3.苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理K562細(xì)胞前后DNMT1

6、mRNA、DNMT3B mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,說(shuō)明苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR未通過(guò)調(diào)控DNMTsmRNA轉(zhuǎn)錄水平而誘導(dǎo)DNA去甲基化。
　　4. HPCE、HPLC法檢測(cè)K562細(xì)胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理后基因組整體甲基化水平較處理前稍降低,而用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法檢測(cè)K562細(xì)胞在苦參堿、苦參提取液、5-Aza CdR處理前后對(duì)基因組整體甲基化水平無(wú)明顯影響,綜合說(shuō)明苦參堿、苦參提取液對(duì)