白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白Rta2p生物活性位點(diǎn)的研究.pdf

1、近年來，隨著器官移植后免疫抑制劑的使用，廣譜抗生素的大量使用，系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)生率急劇升高，尤其以白念珠菌感染最為普遍、嚴(yán)重。開展以深部真菌感染主要病原菌白念珠菌為代表的真菌耐藥機(jī)制研究，尋找新的抗真菌藥物作用靶點(diǎn)，對于創(chuàng)建抗真菌藥物篩選新模型，設(shè)計(jì)開發(fā)新型抗真菌藥物，從而克服真菌感染及其耐藥性，防治日益嚴(yán)重的深部真菌感染具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)了新的耐藥基因RTA2，并已證明鈣離子通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路上調(diào)

2、RTA2基因的表達(dá)，其編碼蛋白Rta2p是白念珠菌鞘脂成分的異位酶，定位于細(xì)胞膜脂筏，能將細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)鞘脂骨架成分--長鏈堿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外側(cè)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的鞘脂成分分布，增強(qiáng)脂筏的穩(wěn)定性。因此，本課題通過進(jìn)一步研究Rta2p蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，發(fā)現(xiàn)一些與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路、與長鏈堿結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的生物學(xué)活性位點(diǎn)，將會(huì)對白念珠菌耐藥性形成的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物靶標(biāo)，設(shè)計(jì)新型抗真菌抑制劑奠定理論基礎(chǔ)。
　　 通過白念

3、珠菌基因組數(shù)據(jù)庫和釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)同源蛋白(Rsb1p，Yer185w，Rta1p，Ylr046c)；其中Rta2p和Rsb1p具有長鏈堿二氫鞘氨醇轉(zhuǎn)運(yùn)活性，其他同源蛋白為七次跨膜的膜蛋白，并且均為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。通過Blast比對，找出了跨膜區(qū)中的保守序列，設(shè)計(jì)將需要考察的位點(diǎn)突變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)差異較大，性質(zhì)相反的氨基酸，本課題共設(shè)計(jì)16個(gè)突變點(diǎn)。首先，據(jù)此設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物，用PCR方法擴(kuò)增突變質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至超感受態(tài)細(xì)

4、胞，抽提質(zhì)粒得到大量突變質(zhì)粒，通過基因測序和Blast比對目的突變點(diǎn)，得到14個(gè)目的突變質(zhì)粒。然后，根據(jù)同源重組原理，利用LiAC轉(zhuǎn)染法將線性突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RTA2缺失菌JXM101中，并利用RTA2特異性引物和套氏PCR方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌。將所有Rta2p突變菌通過敏感性相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)突變菌M10-1(G234S)與RTA2回復(fù)菌JXM201差異較明顯，與空載體回復(fù)菌P-B類似，在高鈣條件下MIC80值無明顯變化，不能誘導(dǎo)真菌

5、耐藥性的形成，而在低鈣條件下和缺失菌一樣，對氟康唑表現(xiàn)得更為敏感；而突變菌M3-1(G158E)與RTA2回復(fù)菌JXM201差異并不明顯，在鈣離子存在時(shí)并未完全耐藥，不能完全誘導(dǎo)真菌耐藥性的形成。其他突變菌和RTA2回復(fù)菌JXM201無明顯差異，在加入Ca2+后均對氟康唑的敏感性降低。另外，通過各突變菌對氟康唑的生長曲線影響和時(shí)間殺菌曲線等實(shí)驗(yàn)也可證明突變菌M10-1(G234S)對氟康唑的敏感性有所改變。通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察突變RTA

6、2對菌株毒力的影響以及FLC治療效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)氟康唑治療后，突變菌M10-1感染動(dòng)物的生存率較JXM201感染動(dòng)物有所提高。最后，通過考察各突變菌對熒光底物二氫鞘氨醇(NBD-DHS)的外排、攝入情況，以及對鞘胺醇代謝通路的上下游抑制劑敏感性等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M10-1(G234S)對底物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力受到影響，即對NBD-DHS定量攝入后外排釋放量減少，并且對鞘脂代謝通路下游抑制劑的敏感性較RTA2回復(fù)菌JXM201有明顯差異。
　　 因此

7、，通過對白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白Rta2p跨膜區(qū)保守序列突變后的菌株耐藥性和轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究，我們發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)中高保守區(qū)域?yàn)镽TA2重要功能域，通過考察Rta2p跨膜區(qū)不同位點(diǎn)突變前后對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路調(diào)控的耐藥性形成的影響以及對底物長鏈堿二氫鞘氨醇(NBD-DHS)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的改變，發(fā)現(xiàn)突變菌M10-1(G234S)與RTA2回復(fù)菌JXM201差異較明顯，而與空載體回復(fù)株P(guān)-B類似，表現(xiàn)為在高鈣條件下，不能誘導(dǎo)真菌耐藥性的形成；而在低鈣條件下，