人子宮內(nèi)膜對胚胎接受性的初步研究.pdf

1、人類子宮內(nèi)膜對胚胎的接受性存在時間和空間的短暫性，即胚胎著床活動受到“種植窗”的限制，“種植窗”的啟動常常發(fā)生在內(nèi)源性黃體生成素(luteinizinghormone，LH)峰或使用外源性人絨毛促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hCG)(LH的類似物)或黃體酮的第4-5天，關閉發(fā)生在第9-10天。進入到宮腔的胚胎和子宮內(nèi)膜按一定的時、空順序分泌相關蛋白或/和局部因子從而達到相互識別、相互融合完成著床過程。

2、胚胎著床過程的限速步驟是胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過程同步。而LH峰是促進卵子成熟、胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜向接受態(tài)同步轉(zhuǎn)化的、最關鍵的調(diào)節(jié)因素。 如何評估胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜向接受態(tài)同步轉(zhuǎn)化是預測胚胎著床成功與否的重要指標。 現(xiàn)行評估胚胎發(fā)育潛能的方法包括胚胎形態(tài)學評分和生化指標檢測。然而胚胎評分與胚胎發(fā)育潛能并不完全正相關；胚胎分泌的細胞因子和蛋白類物質(zhì)參與自身發(fā)育調(diào)節(jié)和胚胎著床過程，被預測可能用來衡量胚胎發(fā)育潛能的標志

3、物。本論文將在我們前期工作基礎上進一步進行人類卵母細胞和種植前胚胎LH表達的研究，為探討LH在人類卵子和胚胎發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)作用提供實驗依據(jù)。 上個世紀五十年代開始，學者們就從組織形態(tài)學、亞細胞結(jié)構(gòu)、局部因子表達及其類固醇激素的調(diào)節(jié)作用等層次對子宮內(nèi)膜胚胎接受性的評價方面做了大量研究，提出上皮細胞吞飲泡(pinopod)、整合素αυβ3、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達部分地反映子宮內(nèi)膜對胚胎的接受性

4、。但由于在胚胎移植周期子宮內(nèi)膜活檢取材的不現(xiàn)實性、被研究因子的獨立與局限、研究方法缺乏時、空連續(xù)性以及多因子表達的同期比較，其結(jié)果不足以真實地反映“種植窗”時期的標志物，也不能解釋在子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能轉(zhuǎn)化過程中局部因子的網(wǎng)絡聯(lián)系和調(diào)節(jié)機制。至今為止，還未能找到一種標志物明確地用于臨床實踐評價子宮內(nèi)膜對胚胎的接受性，選擇胚胎移植時機。 子宮內(nèi)膜對胚胎接受性的功能改變是一個由多基因參與、連續(xù)動態(tài)的復雜過程，不同功能的蛋白質(zhì)在時間與空

5、間上有序協(xié)同作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)組學技術具有觀察多基因事件引起的蛋白質(zhì)組分整體變化、進行時間與空間連續(xù)研究的獨特優(yōu)勢為研究“種植窗”時期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達的變化提供了優(yōu)良的技術平臺。 本論文采用熒光差異凝膠電泳(two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis，2D-DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorpti

6、on/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)建立了正常生育能力婦女“種植窗”時期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)組學研究體系和蛋白質(zhì)表達譜，初步鑒定了32個差異表達蛋白，為進一步篩選“種植窗”時期標志蛋白，揭示子宮內(nèi)膜對胚胎接受性調(diào)控的分子機制提供有力的基礎實驗依據(jù)。 第一部分黃體生成素在人類卵母細胞和種植前胚胎的表達研究目的:人類卵母細胞和種植前胚胎LH的表達。 研究

7、方法:采用免疫熒光標記、激光共聚焦顯微鏡觀察體內(nèi)成熟和不成熟卵母細胞以及種植前胚胎LH的表達。 研究結(jié)果:1.人類卵母細胞和種植前胚胎均存在LH的表達，表達強度隨胚胎發(fā)育加強。 2.體內(nèi)不成熟、成熟卵母細胞、2-8細胞階段的種植前胚胎LH主要分布在細胞膜，細胞連接處表達降低；桑葚胚、囊胚細胞膜和細胞漿同時存在LH表達。 3.多精受精和正常受精組、新鮮胚胎和凍融胚胎組LH表達率無統(tǒng)計學差異。 第二部分人類“

8、種植窗”時期子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)表達研究研究目的:1.建立人類“種植窗”時期子宮內(nèi)膜蛋白2D-DIGE和MALDI-TOF-MS研究體系。 2.獲得正常生育婦女“種植窗”時期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)2D-DIGE圖譜。 3.利用質(zhì)譜技術鑒定差異蛋白，探討它們與“種植窗”的關系。 4.選取其中1-2個差異蛋白進行“種植窗”時期在體子宮內(nèi)膜組織表達的定位和半定量驗證。 研究方法:1.4例正常生育能力婦女志愿進入本研究，采用

9、經(jīng)陰道超聲檢測卵泡發(fā)育，結(jié)合血、尿LH激素測定確定LH峰日。 2.通過組織微創(chuàng)活檢分別獲取“種植窗”前(LH+2天)和“種植窗”時期(LH+7天)的子宮內(nèi)膜組織樣本8份，每份樣本分為兩部分：一部分制備組織切片，行HE染色內(nèi)膜形態(tài)學檢查，采用免疫組化SP法檢測雌激素受體(estrogenreceptor，ER)、孕激素受體(progesteronereceptor，PR)；另一部分經(jīng)純化、提取總蛋白樣品。 3.蛋白樣品Cy

10、dye染料標記后進行雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)，經(jīng)不同波長的激光掃描后，獲得2D-DIGE表達圖譜，使用DeCyder軟件分析，選取差異表達的蛋白質(zhì)斑點。 4.通過全自動斑點處理工作站切點、酶解和點樣后，使用利用MALDI-TOF-MS進行蛋白質(zhì)鑒定，并到本地NCBI、在線MASCOT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫驗證。 5.選擇差異表達蛋白—annexinA4應用免疫組化SP

11、法進行子宮內(nèi)膜組織表達的定位檢測，westernblot行半定量分析。 研究結(jié)果:1.子宮內(nèi)膜組織時相LH+2天4例均為分泌早期，LH+7天4例均為分泌中期，兩組腺體與間質(zhì)ER/PR的陽性率(92.5％±2.9％vs50.0％±21.6％；52.5％士26.3％vs37.5％±18.9％；88.8％士6.3％vs37.5％±32.0％；70.0％±21.6％vs62.5％±15.0％)無統(tǒng)計學差異。 2.0.1克子宮內(nèi)膜

12、組織可提取蛋白總量約為1480±420μg。 3.獲得“種植窗”子宮內(nèi)膜蛋白2D-DIGE圖譜，經(jīng)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫分析鑒定差異蛋白32個，其中17個上調(diào)表達，15個下調(diào)表達。 4.AnnexinA4：LH+2天子宮內(nèi)膜上皮表達，LH+7天子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)均有表達；Westernblot顯示LH+7天表達顯著增強。 結(jié)論:1.人類卵母細胞和種植前胚胎存在LH的時空表達。 2.建立人類“種植窗”時期子宮內(nèi)膜組織