氫氣在高氧肺損傷修復(fù)中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　氧療是臨床常用的一種治療手段，但持續(xù)高濃度氧療易引起機(jī)體氧中毒，在新生兒特別是早產(chǎn)兒易導(dǎo)致慢性肺疾病(CLD)或支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的發(fā)生，嚴(yán)重影響患兒健康，目前尚無(wú)確切有效的防治方法。肺泡上皮損傷的正常修復(fù)主要依賴肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECⅡ)的增殖與分化，高氧導(dǎo)致AECⅡ氧化應(yīng)激性損傷，并抑制AECⅡ增殖是BPD發(fā)生的主要機(jī)制之一。傳統(tǒng)抗氧化劑在減輕高氧肺損傷的同時(shí)干擾了正常肺發(fā)育。氫氣(H2)的選擇性抗氧化作

2、用和相對(duì)安全性使H2成為治療多種疾病的研究熱點(diǎn)，但其具體分子機(jī)制不清。叉頭框蛋白O(FoxO)是一類與氧化應(yīng)激、凋亡、增殖、發(fā)育等密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其活性受絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等多種信號(hào)途徑調(diào)控，而業(yè)已證實(shí)H2對(duì)MAPKs信號(hào)通路中重要的關(guān)鍵酶細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38等的活性和PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt活性均具有調(diào)控作用。

3、我們推測(cè)H2可能通過(guò)調(diào)控FoxO信號(hào)途徑對(duì)高氧肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。深入研究H2在高氧肺損傷中的作用及其FoxO信號(hào)機(jī)制可能為臨床防治BPD帶來(lái)新突破，為H2的機(jī)制研究帶來(lái)新進(jìn)展。
　　目的：
　　1.分離培養(yǎng)高純度、高活力的原代早產(chǎn)大鼠AECⅡ細(xì)胞;建立高氧致AECⅡ細(xì)胞損傷模型;建立高氧致新生鼠肺損傷動(dòng)物模型。為后續(xù)H2干預(yù)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　2.觀察H2對(duì)高氧致AECⅡ細(xì)胞損傷的作用，探討其作用是否與Fo

4、xO信號(hào)途徑有關(guān)。
　　3.觀察H2對(duì)高氧致新生鼠肺損傷的作用，探討FoxO信號(hào)途徑在其中的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.SPF級(jí)孕19 d Sprague-Dawley(SD)大鼠，水合氯醛麻醉后剖宮產(chǎn)取出胎鼠，分離肺臟，剪碎，胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化肺組織細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，差速離心和反復(fù)貼壁純化AECⅡ，含10％胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，改良巴氏染色法檢測(cè)細(xì)胞純

5、度，透射電鏡鑒定細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　2.原代AECⅡ體外培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為空氣組和高氧組，高氧組細(xì)胞置于氧體積分?jǐn)?shù)為95％（95％濃度氧）的細(xì)胞氧倉(cāng)中，氧倉(cāng)與空氣組細(xì)胞一并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡及存活情況。
　　3.SD新生大鼠隨機(jī)分為空氣組和高氧組，高氧組大鼠置于氧體積分?jǐn)?shù)為95％的動(dòng)物氧倉(cāng)中，與空氣組大鼠置于同一室內(nèi)。3d，

6、7d，14 d，21 d后取出肺組織行病理學(xué)檢查，輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)，化學(xué)比色法測(cè)定肺組織羥脯氨酸(HYP)含量。
　　4.原代分離培養(yǎng)的AECⅡ隨機(jī)分為空氣組、高氧組、空氣+H2組、高氧+H2組。H2組細(xì)胞用富氫培養(yǎng)基干預(yù)。24 h后觀察AECⅡ的形態(tài)變化;檢測(cè)MTT、細(xì)胞周期和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)觀察細(xì)胞增殖情況;檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位（△Ψ）和凋亡率觀察細(xì)胞損傷情況;檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和超氧化物陰離

7、子(O2-)水平，細(xì)胞培養(yǎng)上清丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性，觀察細(xì)胞氧化損傷和抗氧化能力;Western Blot檢測(cè)細(xì)胞總FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　5.SD新生大鼠隨機(jī)分為空氣組、空氣+富氫生理鹽水組、空氣+H2組、高氧組、高氧+富氫生理鹽水組和高氧+H2組。各高氧組大鼠均置于氧體積分?jǐn)?shù)為95％的動(dòng)物氧倉(cāng)中。H2干預(yù):富氫生理鹽水組大鼠予

8、腹腔注射富氫生理鹽水10 mL/kg，每天2次;H2組大鼠予腹腔注射H2氣體10 mL/kg，每天2次。非H2干預(yù)組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水。14d后，取肺組織做病理學(xué)檢查;檢測(cè)大鼠血清MDA水平和SOD活力;測(cè)定肺組織HYP含量;免疫組化法測(cè)定肺組織α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá);Western blot檢測(cè)肺組織總FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：

9、r>　　1.原代培養(yǎng)的AECⅡ產(chǎn)量較高，每只早產(chǎn)大鼠肺組織可獲得（8.5±1.8）×106 AECⅡ，細(xì)胞活力為(95.0±2.1)％，細(xì)胞純度為（94.3±2.5）％。電鏡可見AECⅡ的特征性結(jié)構(gòu)——細(xì)胞膜表面的微絨毛和胞漿內(nèi)的板層小體。AECⅡ體外培養(yǎng)12h左右開始貼壁生長(zhǎng)，至18h絕大部分細(xì)胞已貼壁伸展，24-48 h細(xì)胞生長(zhǎng)良好，增殖活躍，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72 h后細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差，喪失功能。
　　2.AECⅡ予95％濃度

10、氧刺激24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變形，細(xì)胞間隙增大，增殖較空氣組明顯受抑，凋亡率明顯增加，存活率明顯降低。
　　3.SD新生大鼠高氧暴露3d和7d后肺組織出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺結(jié)構(gòu)紊亂，7d更明顯。14d和21d可見纖維增生，肺泡間隔明顯增寬，肺組織HYP含量較空氣組顯著增高，21 d更為明顯。高氧組RAC值于7d，14d，21d顯著低于空氣組。
　　4.與空氣組比較，空氣+H2組細(xì)胞總FoxO3

11、a蛋白表達(dá)增加，p-FoxO3a蛋白表達(dá)降低，其余各指標(biāo)均無(wú)顯著差異。與空氣組比較，高氧組細(xì)胞OD492值和PCNA蛋白表達(dá)明顯降低，G1期細(xì)胞比例增多而S期細(xì)胞比例減少;細(xì)胞△Ψ降低，凋亡率增加;細(xì)胞內(nèi)ROS和O2-水平增高;細(xì)胞上清MDA含量增高，SOD活性下降;細(xì)胞總FoxO3a蛋白表達(dá)增加，p-FoxO3a蛋白表達(dá)降低;總β-catenin蛋白表達(dá)降低，p-β-catenin蛋白表達(dá)增高。與高氧組比較，H2干預(yù)可減輕高氧引起的上

12、述改變。
　　5.與空氣組比較，空氣+富氫生理鹽水組和空氣+H2組大鼠肺組織均有FoxO3a與β-catenin的輕微激活，其余各指標(biāo)均無(wú)顯著差異;與空氣組比較，高氧組肺發(fā)育受阻，RAC值降低;肺組織間隔增寬，纖維化明顯，肺組織HYP含量增高，α-SMA表達(dá)增高;血清MDA水平升高，SOD活力降低;肺組織總FoxO3a蛋白表達(dá)增加，且較H2干預(yù)空氣組顯著，p-FOXO3蛋白表達(dá)降低;總β-catenin蛋白表達(dá)增加，p-β-cat

13、enin蛋白表達(dá)亦增高。與高氧組比較，高氧+富氫生理鹽水組和高氧+H2組肺損傷均有所減輕，均一定程度恢復(fù)了高氧引起的上述改變。高氧+H2組血清MDA水平和肺組織HYP含量較高氧+富氫生理鹽水組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)兩組間無(wú)差異。
　　結(jié)論
　　1.采用胰酶聯(lián)合膠原酶消化、差速離心和反復(fù)貼壁的方法獲得的原代AECⅡ產(chǎn)量、純度和活力均較高，可滿足細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的需要。AECⅡ體外培養(yǎng)24-48 h生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，適合做體外

14、研究。
　　2.95％濃度氧可誘導(dǎo)AECⅡ的損傷、凋亡并抑制其增殖，也可導(dǎo)致新生鼠肺損傷和肺發(fā)育受阻，成功建立高氧致AECⅡ細(xì)胞損傷模型和高氧致新生鼠肺損傷動(dòng)物模型。
　　3.富氫培養(yǎng)基能一定程度減輕高氧導(dǎo)致的AECⅡ凋亡、氧化損傷，并促進(jìn)其增殖，而對(duì)正常AECⅡ的增殖無(wú)明顯作用。
　　4.腹腔注射富氫生理鹽水和H2氣體均可有效減輕高氧導(dǎo)致的肺損傷，減輕肺纖維化，腹腔注射H2氣體的效果略佳。H2對(duì)正常肺組織無(wú)明顯作用。