氫氣在高氧肺損傷修復中的作用及相關機制研究.pdf

1、背景：
　　氧療是臨床常用的一種治療手段，但持續(xù)高濃度氧療易引起機體氧中毒，在新生兒特別是早產(chǎn)兒易導致慢性肺疾病(CLD)或支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的發(fā)生，嚴重影響患兒健康，目前尚無確切有效的防治方法。肺泡上皮損傷的正常修復主要依賴肺泡Ⅱ型上皮細胞(AECⅡ)的增殖與分化，高氧導致AECⅡ氧化應激性損傷，并抑制AECⅡ增殖是BPD發(fā)生的主要機制之一。傳統(tǒng)抗氧化劑在減輕高氧肺損傷的同時干擾了正常肺發(fā)育。氫氣(H2)的選擇性抗氧化作

2、用和相對安全性使H2成為治療多種疾病的研究熱點，但其具體分子機制不清。叉頭框蛋白O(FoxO)是一類與氧化應激、凋亡、增殖、發(fā)育等密切相關的轉錄因子，其活性受絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等多種信號途徑調控，而業(yè)已證實H2對MAPKs信號通路中重要的關鍵酶細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38等的活性和PI3K/Akt信號通路中Akt活性均具有調控作用。

3、我們推測H2可能通過調控FoxO信號途徑對高氧肺損傷發(fā)揮保護作用。深入研究H2在高氧肺損傷中的作用及其FoxO信號機制可能為臨床防治BPD帶來新突破，為H2的機制研究帶來新進展。
　　目的：
　　1.分離培養(yǎng)高純度、高活力的原代早產(chǎn)大鼠AECⅡ細胞;建立高氧致AECⅡ細胞損傷模型;建立高氧致新生鼠肺損傷動物模型。為后續(xù)H2干預實驗及機制研究奠定基礎。
　　2.觀察H2對高氧致AECⅡ細胞損傷的作用，探討其作用是否與Fo

4、xO信號途徑有關。
　　3.觀察H2對高氧致新生鼠肺損傷的作用，探討FoxO信號途徑在其中的可能機制。
　　方法：
　　1.SPF級孕19 d Sprague-Dawley(SD)大鼠，水合氯醛麻醉后剖宮產(chǎn)取出胎鼠，分離肺臟，剪碎，胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化肺組織細胞，制成細胞懸液，差速離心和反復貼壁純化AECⅡ，含10％胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。臺盼藍染色法檢測細胞活力，改良巴氏染色法檢測細胞純

5、度，透射電鏡鑒定細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況。
　　2.原代AECⅡ體外培養(yǎng)24 h后，隨機分為空氣組和高氧組，高氧組細胞置于氧體積分數(shù)為95％（95％濃度氧）的細胞氧倉中，氧倉與空氣組細胞一并放于細胞培養(yǎng)箱中。24 h后觀察細胞形態(tài)，MTT檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞的凋亡及存活情況。
　　3.SD新生大鼠隨機分為空氣組和高氧組，高氧組大鼠置于氧體積分數(shù)為95％的動物氧倉中，與空氣組大鼠置于同一室內(nèi)。3d，

6、7d，14 d，21 d后取出肺組織行病理學檢查，輻射狀肺泡計數(shù)(RAC)，化學比色法測定肺組織羥脯氨酸(HYP)含量。
　　4.原代分離培養(yǎng)的AECⅡ隨機分為空氣組、高氧組、空氣+H2組、高氧+H2組。H2組細胞用富氫培養(yǎng)基干預。24 h后觀察AECⅡ的形態(tài)變化;檢測MTT、細胞周期和增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達觀察細胞增殖情況;檢測細胞線粒體膜電位（△Ψ）和凋亡率觀察細胞損傷情況;檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)和超氧化物陰離

7、子(O2-)水平，細胞培養(yǎng)上清丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性，觀察細胞氧化損傷和抗氧化能力;Western Blot檢測細胞總FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表達。
　　5.SD新生大鼠隨機分為空氣組、空氣+富氫生理鹽水組、空氣+H2組、高氧組、高氧+富氫生理鹽水組和高氧+H2組。各高氧組大鼠均置于氧體積分數(shù)為95％的動物氧倉中。H2干預:富氫生理鹽水組大鼠予

8、腹腔注射富氫生理鹽水10 mL/kg，每天2次;H2組大鼠予腹腔注射H2氣體10 mL/kg，每天2次。非H2干預組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水。14d后，取肺組織做病理學檢查;檢測大鼠血清MDA水平和SOD活力;測定肺組織HYP含量;免疫組化法測定肺組織α-平滑肌激動蛋白（α-SMA）表達;Western blot檢測肺組織總FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表達。
　　結果：

9、r>　　1.原代培養(yǎng)的AECⅡ產(chǎn)量較高，每只早產(chǎn)大鼠肺組織可獲得（8.5±1.8）×106 AECⅡ，細胞活力為(95.0±2.1)％，細胞純度為（94.3±2.5）％。電鏡可見AECⅡ的特征性結構——細胞膜表面的微絨毛和胞漿內(nèi)的板層小體。AECⅡ體外培養(yǎng)12h左右開始貼壁生長，至18h絕大部分細胞已貼壁伸展，24-48 h細胞生長良好，增殖活躍，處于對數(shù)生長期，72 h后細胞狀態(tài)逐漸變差，喪失功能。
　　2.AECⅡ予95％濃度

10、氧刺激24 h后，細胞出現(xiàn)皺縮變形，細胞間隙增大，增殖較空氣組明顯受抑，凋亡率明顯增加，存活率明顯降低。
　　3.SD新生大鼠高氧暴露3d和7d后肺組織出現(xiàn)肺泡上皮細胞腫脹，間質充血水腫，炎性細胞浸潤，肺結構紊亂，7d更明顯。14d和21d可見纖維增生，肺泡間隔明顯增寬，肺組織HYP含量較空氣組顯著增高，21 d更為明顯。高氧組RAC值于7d，14d，21d顯著低于空氣組。
　　4.與空氣組比較，空氣+H2組細胞總FoxO3

11、a蛋白表達增加，p-FoxO3a蛋白表達降低，其余各指標均無顯著差異。與空氣組比較，高氧組細胞OD492值和PCNA蛋白表達明顯降低，G1期細胞比例增多而S期細胞比例減少;細胞△Ψ降低，凋亡率增加;細胞內(nèi)ROS和O2-水平增高;細胞上清MDA含量增高，SOD活性下降;細胞總FoxO3a蛋白表達增加，p-FoxO3a蛋白表達降低;總β-catenin蛋白表達降低，p-β-catenin蛋白表達增高。與高氧組比較，H2干預可減輕高氧引起的上

12、述改變。
　　5.與空氣組比較，空氣+富氫生理鹽水組和空氣+H2組大鼠肺組織均有FoxO3a與β-catenin的輕微激活，其余各指標均無顯著差異;與空氣組比較，高氧組肺發(fā)育受阻，RAC值降低;肺組織間隔增寬，纖維化明顯，肺組織HYP含量增高，α-SMA表達增高;血清MDA水平升高，SOD活力降低;肺組織總FoxO3a蛋白表達增加，且較H2干預空氣組顯著，p-FOXO3蛋白表達降低;總β-catenin蛋白表達增加，p-β-cat

13、enin蛋白表達亦增高。與高氧組比較，高氧+富氫生理鹽水組和高氧+H2組肺損傷均有所減輕，均一定程度恢復了高氧引起的上述改變。高氧+H2組血清MDA水平和肺組織HYP含量較高氧+富氫生理鹽水組低，差異有統(tǒng)計學意義，其余指標兩組間無差異。
　　結論
　　1.采用胰酶聯(lián)合膠原酶消化、差速離心和反復貼壁的方法獲得的原代AECⅡ產(chǎn)量、純度和活力均較高，可滿足細胞學實驗研究的需要。AECⅡ體外培養(yǎng)24-48 h生長狀態(tài)最佳，適合做體外

14、研究。
　　2.95％濃度氧可誘導AECⅡ的損傷、凋亡并抑制其增殖，也可導致新生鼠肺損傷和肺發(fā)育受阻，成功建立高氧致AECⅡ細胞損傷模型和高氧致新生鼠肺損傷動物模型。
　　3.富氫培養(yǎng)基能一定程度減輕高氧導致的AECⅡ凋亡、氧化損傷，并促進其增殖，而對正常AECⅡ的增殖無明顯作用。
　　4.腹腔注射富氫生理鹽水和H2氣體均可有效減輕高氧導致的肺損傷，減輕肺纖維化，腹腔注射H2氣體的效果略佳。H2對正常肺組織無明顯作用。