環(huán)氧合酶-2基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞的抗增殖作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：環(huán)氧合酶-2(COX-2)是參與催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，在大多數(shù)正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，而在多種因素如各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、癌基因產(chǎn)物等作用下大量表達(dá)，參與炎癥和惡性組織中前列腺素的合成。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在80％以上的結(jié)直腸癌和部分肺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌、乳腺癌和頭頸癌組織中異常表達(dá)。流行病學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)的研究表明，COX-2通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，增

2、加癌細(xì)胞侵襲以及免疫抑制作用等多方面的機(jī)制參與了某些腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。 方法：一、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)兩種人HCC細(xì)胞株HepG2、Hep3B，兩株人正常肝細(xì)胞QSG7701和L02以及皮膚成纖維細(xì)胞Fb細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA的表達(dá)，并考察環(huán)氧合酶抑制劑雙氯芬酸對(duì)不同細(xì)胞增殖的影響，以探討COX-2的表達(dá)和COX-2抑制劑抗HCC細(xì)胞增殖的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察了雙氯芬酸和化療藥5-Fu對(duì)HCC細(xì)胞COX-

3、2mRNA表達(dá)的影響； 二、設(shè)計(jì)靶向COX-2基因的RNA干擾序列，構(gòu)建作用于COX-2mRNA的發(fā)卡狀RNA(COX-2shRNA)的表達(dá)載體，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000分別進(jìn)行HepG2細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的細(xì)胞。運(yùn)用半定量RT-PCR檢測(cè)COX-2mRNA表達(dá)水平的變化，篩選有效抑制COX-2基因表達(dá)的序列； 三、采用CCK-8法考察COX-2shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

4、HepG2細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性的影響，分別以DNA梯形條帶形成實(shí)驗(yàn)、透射電子顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)考察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后DNA降解情況、凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞凋亡比例以及細(xì)胞周期阻滯情況，確定細(xì)胞通過何種途徑引起生長(zhǎng)抑制； 四、運(yùn)用RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)COX-2shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后對(duì)COX-2及下游信號(hào)分子的影響，以探討COX-2在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制。 結(jié)果：人HC

5、C細(xì)胞HepG2、Hep3B和正常肝細(xì)胞系L02均高表達(dá)COX-2mRNA，而正常肝細(xì)胞QSG7701COX-2mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于前三者。人皮膚成纖維細(xì)胞Fb不表達(dá)COX-2mRNA。雙氯芬酸10～200μmol/L作用72h后，濃度依賴性抑制HepG2和Hep3B的增殖，在10μmol/L的濃度時(shí)即顯現(xiàn)顯著的抗增殖作用(P＜0.01)，其半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為76.41和35.21μmol/L。雙氯芬酸在濃度為25μm

6、ol/L以上時(shí)顯著地抑制表達(dá)COX-2的人正常肝細(xì)胞L02的增殖(P＜0.01)，其IC50值為87.44μmol/L。QSG7701對(duì)雙氯芬酸的敏感性遠(yuǎn)低于上述三種細(xì)胞，在濃度大于50μmol/L時(shí)才表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用(P＜0.01)，IC50為170.23μmol/L。雙氯芬酸僅在濃度超過200μmol/L時(shí)才對(duì)Fb細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。上述結(jié)果表明，雙氯芬酸對(duì)表達(dá)COX-2的HepG2、Hep3B和L02細(xì)胞有顯著的抗增殖作用

7、，對(duì)微弱表達(dá)COX-2的QSG7701作用弱的多，而對(duì)不表達(dá)COX-2的Fb細(xì)胞濃度在100μmol/L以下時(shí)無(wú)抗增殖作用。也就是說，雙氯芬酸特異性抑制表達(dá)COX-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。 雙氯芬酸50μmol/L處理HepG2細(xì)胞72h后，COX-2mRNA表達(dá)量明顯上升，與對(duì)照相比上調(diào)了36.80％(P＜0.01)，5-Fu5μg/mL作用72hCOX-2mRNA表達(dá)上調(diào)了27.12％(P＜0.05)。雙氯芬酸50μmol/L和5-F

8、u5μg/mL作用Hep3B細(xì)胞72h后，分別使COX-2mRNA表達(dá)上調(diào)了83.56和79.09％(P＜0.01)。雙氯芬酸上調(diào)HepG2細(xì)胞COX-2mRNA的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而5-Fu上調(diào)COX-2mRNA表達(dá)的作用可能是HCC對(duì)5-Fu敏感性不佳的原因之一。 PCR和質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果證明已成功構(gòu)建COX-2shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并經(jīng)PCR檢測(cè)篩選出一有效抑制COX-2基因表達(dá)的序列。轉(zhuǎn)染COX-2shRN

9、A表達(dá)載體后細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷下降的趨勢(shì)，24h后下降為錯(cuò)義序列對(duì)照組的74.49±5.45％，48h下降為54.21±5.8％，72h后為42.64±6.42％。為排除細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的干擾，對(duì)轉(zhuǎn)染COX-2shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行G418篩選。RT-PCR檢測(cè)顯示，細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA水平下降了75.30％(P＜0.01)，表明經(jīng)篩選所獲得的穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的細(xì)胞COX-2基因沉默效應(yīng)增強(qiáng)。

10、 采用CCK-8法對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染COX-2shRNA表達(dá)載體24、48和72h后細(xì)胞增殖活性呈時(shí)間依賴性的降低，分別下降為轉(zhuǎn)染錯(cuò)義質(zhì)粒對(duì)照組的87.00±9.97％，82.50±8.88％和80.12±10.66％?？紤]到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可能因轉(zhuǎn)染效率干擾抗增殖效應(yīng)，我們進(jìn)一步考察穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞增殖活性的變化。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的細(xì)胞增殖活性較表達(dá)錯(cuò)義序列的細(xì)

11、胞下降了29.33％(P＜0.01)，提示COX-2基因沉默可在一定程度上抑制表達(dá)COX-2的HepG2細(xì)胞的增殖。 利用透射電子顯微鏡對(duì)表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察顯示，穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的細(xì)胞中存在自發(fā)性的凋亡現(xiàn)象，視野內(nèi)可見相當(dāng)數(shù)量的凋亡細(xì)胞，主要特征為染色質(zhì)凝聚，電子密度增高，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡以及脂膜包裹的顆粒等現(xiàn)象。提取細(xì)胞DNA進(jìn)行凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48h提取的DNA開始形成明

12、顯的梯形條帶，72h更為明顯，96h后仍然存在。穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的細(xì)胞的DNA電泳同樣可形成明顯的梯形條帶。上述結(jié)果表明COX-2shRNA可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞核內(nèi)DNA發(fā)生片斷化斷裂從而形成梯形條帶。 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞進(jìn)行凋亡率和細(xì)胞周期分析顯示，未轉(zhuǎn)染和表達(dá)錯(cuò)義序列的細(xì)胞自發(fā)性凋亡細(xì)胞的比例很少，凋亡率僅為4.47±2.80％和4.63±1.55％，而穩(wěn)定表達(dá)COX-2s

13、hRNA的細(xì)胞出現(xiàn)了較高的凋亡比例，凋亡率為17.83±1.26％。 為探討COX-2基因沉默后下游信號(hào)分子的改變，以闡明COX-2基因沉默通過何種方式引發(fā)細(xì)胞凋亡，我們采用RT-PCR方法檢測(cè)了COX-2shRNA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白survivin和Bcl-2mRNA的影響。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞survivin和Bcl-2mRNA下降為錯(cuò)義組的30.91±4.59％和45.12±11

14、.69％，表明COX-2基因沉默下調(diào)survivin(P＜0.01)和Bcl-2mRNA的水平(P＜0.01)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在腫瘤血管生成和侵襲中起關(guān)鍵作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染COX-2shRNA后，VEGF和MMP-2mRNA分別下降為錯(cuò)義組的55.85±4.85％和35.30±10.75％，表明COX-2基因沉默可抑制VEGF(P＜0.01)和MMP-2

15、mRNA(P＜0.01)的表達(dá)，提示在HCC血管形成和轉(zhuǎn)移侵襲的過程中，COX-2通過上調(diào)VEGF和MMP-2的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)作用。 用免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白水平下降為表達(dá)錯(cuò)義序列組的31.25±5.17％(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染錯(cuò)義質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染的組之間無(wú)顯著性差異。此結(jié)果進(jìn)一步從蛋白水平證明COX-2shRNA可有效地抑制COX-2基因的表達(dá)。我們同時(shí)測(cè)定了Bcl-2水平的變

16、化，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)COX-2shRNA的HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的水平下降為錯(cuò)義序列組的54.93±6.64％，表明COX-2基因沉默后Bcl-2的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。 結(jié)論：雙氯芬酸特異性地抑制表達(dá)COX-2的HCC細(xì)胞的增殖，提示COX-2在HCC細(xì)胞的增殖中發(fā)揮作用。利用COX-2shRNA表達(dá)載體進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA干擾的方法可有效地在mRNA和蛋白水平抑制肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞COX-2基因的表達(dá)，

17、并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抗增殖作用。5-Fu增強(qiáng)HCC細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA的表達(dá)，COX-2基因沉默顯著提高細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性，提示COX-2可能與HCC對(duì)化療的抵抗有關(guān)。COX-2基因沉默后下調(diào)抗凋亡蛋白survivin和Bcl-2的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯，從而產(chǎn)生抗HepG2細(xì)胞增殖的作用。在血管生成和癌細(xì)胞侵襲中起重要作用的VEGF和MMP-2mRNA的水平在COX-2基因沉默后下降則提示COX-2在HCC的血管