MAGI-2抑制人肝癌細胞的遷移和增殖及其分子機制研究.pdf

1、肝癌的惡性程度高，發(fā)生發(fā)展迅速，預(yù)后不良。因此對其發(fā)生和發(fā)展的機制進行研究顯得很有必要。支架蛋白MAGI-2(Membrane-associated guanylate kinase inverted-2)是一個包含多個功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，主要功能是作為一個支架蛋白在細胞膜處募集和錨定一些細胞信號蛋白形成高分子復(fù)合體，從而發(fā)揮細胞信號轉(zhuǎn)導的作用，并且能夠穩(wěn)定錨定處細胞膜的結(jié)構(gòu)。MAGI-2基因定位于人染色體7q21，曾被認為是一個潛在的

2、腫瘤抑制基因。但是，目前對其抑制腫瘤細胞生物學行為的相關(guān)信號通路的研究不是很多，對其分子機制的了解并不完全清楚，對其進行研究可以為臨床治療肝癌提供新的思路和治療手段。因此，我們擬從基本的信號轉(zhuǎn)導通路著手，探討MAGI-2蛋白質(zhì)信號轉(zhuǎn)導通路對腫瘤細胞遷移和增殖的影響及相應(yīng)的分子機制。 第一部分 MAGI-2對人肝癌細胞的遷移和增殖的抑制作用已有研究表明，MAGI-2蛋白質(zhì)也稱S-SCAM(synaptic scaffolding

3、molecule)，是一個170KDa大小，在腦組織中高表達，而在其他組織中低表達的蛋白分子。在此研究中，我們首先選擇了八株人肝癌細胞，檢測其是否有MAGI-2蛋白質(zhì)的表達，結(jié)果顯示：只有SMMC-7721細胞中有MAGI-2的表達。既然人肝癌細胞中存在MAGI-2蛋白質(zhì)的表達，說明MAGI-2在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。為此，我們從中選擇了三株肝癌細胞：SMMC-7721(以下統(tǒng)稱為7721)(有MAGl-2蛋白質(zhì)表達)，B

4、EL-7404(7404)和MHCC-97H(97H)(沒有MAGI-2蛋白質(zhì)表達)。在此三株細胞中轉(zhuǎn)染帶myc標記的MAGI-2表達質(zhì)粒，用抗myc抗體檢測是否轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染成功后，在此三株細胞中行劃痕法檢測細胞遷移能力的變化，為了避免細胞增殖對遷移的影響，我們先用羥基尿處理細胞使其增殖受到抑制，另外又行transwell法進一步驗證這個結(jié)果。并且，行MTT法和流式細胞檢測細胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，在此三株細胞中轉(zhuǎn)染myc-MAG

5、I-2質(zhì)粒后，細胞遷移和增殖能力均受到抑制，且細胞發(fā)生G1期阻滯。同時，我們還進一步用western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后此三株細胞中FAK信號通路、P13K/Akt信號通路和MAPK信號通路中的信號分子的變化，發(fā)現(xiàn)中FAK和Akt蛋白質(zhì)的總量沒有明顯的變化，但是FAK和Akt的磷酸化水平卻顯著降低，并且與細胞增殖密切相關(guān)的p27蛋白質(zhì)水平也相應(yīng)升高。但是，ERK1/2蛋白質(zhì)的總量和磷酸化水平均沒有明顯的變化。綜上所述，該部分實驗結(jié)果

6、提示：MAGI-2蛋白質(zhì)對人肝癌細胞的遷移和增殖都有抑制作用，并且該抑制作用與FAK和Akt的磷酸化密切相關(guān)，而與ERK1/2的磷酸化關(guān)系不大。 第二部分 PTEN參與MAGI-2對人肝癌細胞遷移和增殖抑制的分子機制的研究PTEN蛋白質(zhì)是一個具有雙專一性磷酸酶活性的抑癌基因的產(chǎn)物，其脂質(zhì)磷酸酶活性能夠促進PIP3的3'位脫磷酸化，影響Akt及其后的信號通路的活化。PTEN通過PI-3K/Akt信號途徑發(fā)揮抑制細胞生長和誘導細胞凋

7、亡兩種作用。其蛋白磷酸酶活性能下調(diào)FAK的磷酸化，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞侵襲、阻斷細胞的局部粘附與遷移的作用。MAGI-2對人肝癌細胞的遷移和增殖的抑制作用是否可能通過PTEN發(fā)揮作用，值得深入研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒后，三株細胞中PTEN蛋白質(zhì)表達水平都升高。用半定量RT-PCR方法檢測此三株細胞中PTEN mRNA水平的變化和CHX(cycloheximide)處理7721細胞后western blot檢測其PTE

8、N半衰期的變化，結(jié)果顯示，myc-MAGI-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，并不影響PTEN mRNA水平，但是PTEN蛋白質(zhì)的降解速度減慢。應(yīng)用有效的針對PTEN的RNA干擾技術(shù)，進一步探討了PTEN在MAGI-2抑制細胞遷移和增殖效應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，在人肝癌7721細胞中，PTEN的mRNA被干擾后，其蛋白質(zhì)表達下調(diào)，細胞遷移和增殖能力升高，F(xiàn)AK和Akt的磷酸化水平發(fā)生上調(diào)。再轉(zhuǎn)染MAGI-2表達質(zhì)粒，對PTEN蛋白質(zhì)的影響很小，細胞遷移和

9、增殖能力幾乎沒有變化，同時對FAK和Akt的磷酸化水平影響也很小。綜上所述，該部分實驗提示：PTEN參與了MAGI-2對人肝癌細胞遷移和增殖的抑制作用，且PTEN蛋白質(zhì)的上調(diào)是MAGI-2抑制細胞遷移和增殖所必須的。 第三部分進一步在U87MG細胞和Hela細胞中驗證PTEN參與MAGI-2對腫瘤細胞遷移和增殖的抑制作用既然，在人肝癌細胞中，轉(zhuǎn)染MAGI-2表達質(zhì)粒能通過下調(diào)FAK和Akt的磷酸化水平達到抑制細胞遷移和增殖的效應(yīng)

10、，且PTEN蛋白質(zhì)在此過程中發(fā)揮了重要的作用。為進一步研究PTEN在MAGI-2誘導的細胞遷移和增殖抑制中的作用，我們選擇了兩株人的腫瘤細胞，膠質(zhì)瘤細胞-U87MG細胞(僅有PTEN mRNA，無PTEN蛋白質(zhì)表達)和宮頸癌細胞-Hela細胞(有野生型PTEN蛋白質(zhì)表達)。首先，我們檢測這兩株細胞中PTEN和MAGI-2的表達情況，以7721作為陽性對照，結(jié)果顯示，U87MG細胞中沒有PTEN蛋白質(zhì)的表達，但是MAGI-2蛋白質(zhì)能被檢測

11、到。Hela細胞中則有PTEN蛋白質(zhì)的表達。其次，我們將myc-MAGI-2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至這兩株細胞中。其實驗結(jié)果與我們前面得到的結(jié)論一致，U87MG細胞轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒后，行transwell法檢測的U87MG細胞遷移能力并沒有出現(xiàn)明顯的改變，用MTT法檢測的U87MG細胞增殖能力也沒有發(fā)生明顯的變化，且信號蛋白p-FAK，p-AKT和p-ERK1/2的水平也均沒有明顯的降低。而在Hela細胞中轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒