MAGI-2抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和增殖及其分子機(jī)制研究.pdf

1、肝癌的惡性程度高，發(fā)生發(fā)展迅速，預(yù)后不良。因此對(duì)其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究顯得很有必要。支架蛋白MAGI-2(Membrane-associated guanylate kinase inverted-2)是一個(gè)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，主要功能是作為一個(gè)支架蛋白在細(xì)胞膜處募集和錨定一些細(xì)胞信號(hào)蛋白形成高分子復(fù)合體，從而發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并且能夠穩(wěn)定錨定處細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。MAGI-2基因定位于人染色體7q21，曾被認(rèn)為是一個(gè)潛在的

2、腫瘤抑制基因。但是，目前對(duì)其抑制腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)信號(hào)通路的研究不是很多，對(duì)其分子機(jī)制的了解并不完全清楚，對(duì)其進(jìn)行研究可以為臨床治療肝癌提供新的思路和治療手段。因此，我們擬從基本的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路著手，探討MAGI-2蛋白質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和增殖的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。 第一部分 MAGI-2對(duì)人肝癌細(xì)胞的遷移和增殖的抑制作用已有研究表明，MAGI-2蛋白質(zhì)也稱S-SCAM(synaptic scaffolding

3、molecule)，是一個(gè)170KDa大小，在腦組織中高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)的蛋白分子。在此研究中，我們首先選擇了八株人肝癌細(xì)胞，檢測(cè)其是否有MAGI-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示：只有SMMC-7721細(xì)胞中有MAGI-2的表達(dá)。既然人肝癌細(xì)胞中存在MAGI-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，說(shuō)明MAGI-2在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。為此，我們從中選擇了三株肝癌細(xì)胞：SMMC-7721(以下統(tǒng)稱為7721)(有MAGl-2蛋白質(zhì)表達(dá))，B

4、EL-7404(7404)和MHCC-97H(97H)(沒(méi)有MAGI-2蛋白質(zhì)表達(dá))。在此三株細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶myc標(biāo)記的MAGI-2表達(dá)質(zhì)粒，用抗myc抗體檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染成功后，在此三株細(xì)胞中行劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，為了避免細(xì)胞增殖對(duì)遷移的影響，我們先用羥基尿處理細(xì)胞使其增殖受到抑制，另外又行transwell法進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果。并且，行MTT法和流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，在此三株細(xì)胞中轉(zhuǎn)染myc-MAG

5、I-2質(zhì)粒后，細(xì)胞遷移和增殖能力均受到抑制，且細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。同時(shí)，我們還進(jìn)一步用western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后此三株細(xì)胞中FAK信號(hào)通路、P13K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路中的信號(hào)分子的變化，發(fā)現(xiàn)中FAK和Akt蛋白質(zhì)的總量沒(méi)有明顯的變化，但是FAK和Akt的磷酸化水平卻顯著降低，并且與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的p27蛋白質(zhì)水平也相應(yīng)升高。但是，ERK1/2蛋白質(zhì)的總量和磷酸化水平均沒(méi)有明顯的變化。綜上所述，該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6、提示：MAGI-2蛋白質(zhì)對(duì)人肝癌細(xì)胞的遷移和增殖都有抑制作用，并且該抑制作用與FAK和Akt的磷酸化密切相關(guān)，而與ERK1/2的磷酸化關(guān)系不大。 第二部分 PTEN參與MAGI-2對(duì)人肝癌細(xì)胞遷移和增殖抑制的分子機(jī)制的研究PTEN蛋白質(zhì)是一個(gè)具有雙專一性磷酸酶活性的抑癌基因的產(chǎn)物，其脂質(zhì)磷酸酶活性能夠促進(jìn)PIP3的3'位脫磷酸化，影響Akt及其后的信號(hào)通路的活化。PTEN通過(guò)PI-3K/Akt信號(hào)途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋

7、亡兩種作用。其蛋白磷酸酶活性能下調(diào)FAK的磷酸化，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、阻斷細(xì)胞的局部粘附與遷移的作用。MAGI-2對(duì)人肝癌細(xì)胞的遷移和增殖的抑制作用是否可能通過(guò)PTEN發(fā)揮作用，值得深入研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒后，三株細(xì)胞中PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)水平都升高。用半定量RT-PCR方法檢測(cè)此三株細(xì)胞中PTEN mRNA水平的變化和CHX(cycloheximide)處理7721細(xì)胞后western blot檢測(cè)其PTE

8、N半衰期的變化，結(jié)果顯示，myc-MAGI-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并不影響PTEN mRNA水平，但是PTEN蛋白質(zhì)的降解速度減慢。應(yīng)用有效的針對(duì)PTEN的RNA干擾技術(shù)，進(jìn)一步探討了PTEN在MAGI-2抑制細(xì)胞遷移和增殖效應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，在人肝癌7721細(xì)胞中，PTEN的mRNA被干擾后，其蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞遷移和增殖能力升高，F(xiàn)AK和Akt的磷酸化水平發(fā)生上調(diào)。再轉(zhuǎn)染MAGI-2表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)PTEN蛋白質(zhì)的影響很小，細(xì)胞遷移和

9、增殖能力幾乎沒(méi)有變化，同時(shí)對(duì)FAK和Akt的磷酸化水平影響也很小。綜上所述，該部分實(shí)驗(yàn)提示：PTEN參與了MAGI-2對(duì)人肝癌細(xì)胞遷移和增殖的抑制作用，且PTEN蛋白質(zhì)的上調(diào)是MAGI-2抑制細(xì)胞遷移和增殖所必須的。 第三部分進(jìn)一步在U87MG細(xì)胞和Hela細(xì)胞中驗(yàn)證PTEN參與MAGI-2對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和增殖的抑制作用既然，在人肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染MAGI-2表達(dá)質(zhì)粒能通過(guò)下調(diào)FAK和Akt的磷酸化水平達(dá)到抑制細(xì)胞遷移和增殖的效應(yīng)

10、，且PTEN蛋白質(zhì)在此過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。為進(jìn)一步研究PTEN在MAGI-2誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和增殖抑制中的作用，我們選擇了兩株人的腫瘤細(xì)胞，膠質(zhì)瘤細(xì)胞-U87MG細(xì)胞(僅有PTEN mRNA，無(wú)PTEN蛋白質(zhì)表達(dá))和宮頸癌細(xì)胞-Hela細(xì)胞(有野生型PTEN蛋白質(zhì)表達(dá))。首先，我們檢測(cè)這兩株細(xì)胞中PTEN和MAGI-2的表達(dá)情況，以7721作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，U87MG細(xì)胞中沒(méi)有PTEN蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是MAGI-2蛋白質(zhì)能被檢測(cè)

11、到。Hela細(xì)胞中則有PTEN蛋白質(zhì)的表達(dá)。其次，我們將myc-MAGI-2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至這兩株細(xì)胞中。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們前面得到的結(jié)論一致，U87MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒后，行transwell法檢測(cè)的U87MG細(xì)胞遷移能力并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的改變，用MTT法檢測(cè)的U87MG細(xì)胞增殖能力也沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，且信號(hào)蛋白p-FAK，p-AKT和p-ERK1/2的水平也均沒(méi)有明顯的降低。而在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染myc-MAGI-2質(zhì)粒