MIR30B在幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)與持續(xù)性感染發(fā)生中的機(jī)制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，與胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和胃癌的發(fā)病密切相關(guān)，WHO已將其列為第一類致癌因子。一般認(rèn)為，H.pylori是一種胞外致病菌，但越來越多的證據(jù)顯示該菌能在胃上皮細(xì)胞中生存增殖，抗生素和機(jī)體免疫反應(yīng)均不能清除胞內(nèi)的H.pylori而導(dǎo)致持續(xù)性感染引起胃部疾病的發(fā)生。深入闡明H.pylori慢性感染機(jī)制對揭示其致病機(jī)理、發(fā)展新的有效

2、的H.pylori感染治療手段具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 自噬(Autophagy)是一種機(jī)體生存、分化、發(fā)育、代謝必需的溶酶體降解途徑，其主要的功能是保護(hù)機(jī)體免受各種致病因素的侵襲，并在抗病原微生物感染及其導(dǎo)致的炎癥中發(fā)揮重要作用。H.pylori感染可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而自噬抑制促進(jìn)H。pylori的胞內(nèi)存活。
　　 microRNA(miRNA)是一類長度約19-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，主要

3、存在于真核生物中，主要通過與靶mRNA3’端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻譯，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染能夠引起胃上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化：MIR155、MIR16、MIR146A、MIR30B、MIR222等表達(dá)出現(xiàn)升高，MIR90B等則表達(dá)下調(diào)(J Infect Dis2009，16-25)，且MIR155和MIR146A有負(fù)性調(diào)控胃上皮細(xì)胞表達(dá)促炎癥因子的

4、作用。同時(shí)，MIR30B不僅在體外感染模型中表達(dá)升高，而且在臨床活檢標(biāo)本中也觀察到MIR30B表達(dá)量在H。pylori感染組胃粘膜組織顯著高于未感染組。另外，在H.pylori感染誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞自噬模型中，我們通過免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MIR30B能明顯抑制自噬信號蛋白LC3的Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變，以及抑制GFP-LC3的熒光蛋白聚集，提示MIR30B參與了H.pylori引起的自噬調(diào)控。那么MIR30B是通過什么機(jī)制來抑制自噬

5、的形成呢？目前尚不清楚。BECN1和ATG12作為自噬信號通路上的兩個(gè)重要分子，在自噬發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。生物信息學(xué)分析顯示：它們可能是MIR30B的靶標(biāo)蛋白。為此，我們提出MIR30B調(diào)節(jié)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞自噬與持續(xù)性感染的如下機(jī)制設(shè)想：MIR30B通過調(diào)節(jié)自噬通路中的信號蛋白BECN1和ATG12而發(fā)揮抑制作用，從而影響到H.pylori被清除，導(dǎo)致H.pylori在自噬體中生存繁殖而發(fā)生持續(xù)感染，引起慢性胃炎、消化性潰

6、瘍，甚至胃癌等疾病。本研究通過H.pylori感染人胃上皮細(xì)胞自噬模型和臨床胃粘膜標(biāo)本的檢測，以MIR30B為研究對象，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對其表達(dá)進(jìn)行鑒定；分別轉(zhuǎn)染MIR30B模擬物及抑制劑上調(diào)和下調(diào)胞內(nèi)MIR30B的水平，采用Western-blot、激光共聚焦、電鏡等技術(shù)觀察MIR30B在H.pylori感染中的自噬變化；結(jié)合生物信息學(xué)和螢光素酶實(shí)驗(yàn)等鑒定MIR30B的靶基因--BECN1和ATG12；并進(jìn)一步通過慶大霉素保護(hù)實(shí)

7、驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究MIR30B抑制自噬對胞內(nèi)H.pylori的清除作用。獲得以下研究結(jié)果：
　　 1.在H.pylori感染人胃上皮AGS細(xì)胞模型中，通過miRNA芯片和實(shí)時(shí)定量PCR觀察到H.pylori感染后MIR30B表達(dá)上調(diào)；同時(shí)在人胃粘膜組織中得到了驗(yàn)證。
　　 2.H.pylori感染能夠誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬，電鏡和慶大霉素保護(hù)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)H。pylori能夠在AGS細(xì)胞內(nèi)存在，抑制自噬可促進(jìn)H.pylori的

8、胞內(nèi)存活。
　　 3.預(yù)測并鑒定了MIR30B的靶基因：BECN1和ATG12，證實(shí)MIR30B通過轉(zhuǎn)錄水平抑制其靶基因從而擾亂自噬。
　　 4.與未感染H.pylori人群相比，感染陽性的病人自噬水平降低，同時(shí)MAP1LC3B的蛋白水平以及BECN1和ATG12 mRNA表達(dá)量明顯下降，并且與MIR30B呈負(fù)相關(guān)。
　　 5.MIR30B可通過抑制其靶蛋白有利于H.pylori在胞內(nèi)的存活。
　　 固有

9、免疫應(yīng)答作為機(jī)體抵抗病原微生物感染的一種重要的防衛(wèi)機(jī)制，在抵抗H。pylori感染中發(fā)揮重要的作用。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88，MYD88)是Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵銜接分子。研究表明MYD88參與調(diào)控H.pylori感染過程中的TLR信號通路。前期研究發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染所致炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)宿主表達(dá)升高的MIR155能通過抑制靶蛋白的表達(dá)而負(fù)性調(diào)控促炎癥因子

10、的表達(dá)。生物信息學(xué)分析提示，MYD88可能是MIR155的靶蛋白。本文首先通過螢光素酶實(shí)驗(yàn)和熒光蛋白實(shí)驗(yàn)鑒定了MYD88是MIR155的靶蛋白，并采用Western-blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)證實(shí)了MIR155通過抑制MYD88的翻譯發(fā)揮作用；進(jìn)一步，采用siRNA干擾技術(shù)、轉(zhuǎn)染MIR155模擬物及抑制劑，通過ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測促炎癥因子IL-8的表達(dá)情況，證實(shí)MIR155在幽門螺桿菌感染中通過