結(jié)核分枝桿菌潛伏相關(guān)抗原Rv2657c表位預(yù)測(cè)、重組蛋白制備及其免疫學(xué)特性的初步研究.pdf

1、結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的傳染病，主要通過(guò)呼吸道傳播。據(jù)報(bào)道2015年結(jié)核病患者已超過(guò)1000萬(wàn)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。MTB感染人體后可出現(xiàn)三種不同的結(jié)果，一是機(jī)體免疫力較好，MTB直接被清除;二是MTB被機(jī)體免疫抑制，但也不能完全清除，發(fā)展為結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI);三是MTB在機(jī)體內(nèi)迅速增殖，發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核

2、病。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球1/3的人口是MTB的潛伏感染人群，而新發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核患者有85％-90％是由潛伏感染人群發(fā)展而來(lái)，故若能早期診斷LTBI者，并盡早對(duì)其進(jìn)行預(yù)防治療可大大降低結(jié)核病的發(fā)病率。但是目前缺乏監(jiān)測(cè)、診斷LTBI的有效而可靠的標(biāo)志物。LTBI的篩查對(duì)于結(jié)核病的防控具有重要的意義和價(jià)值。本研究的目的是試圖發(fā)現(xiàn)LTBI的診斷標(biāo)記物。
　　在機(jī)體處于LTBI階段時(shí)，潛伏感染相關(guān)蛋白會(huì)上調(diào)表達(dá)，有可能成為潛伏感染的診斷標(biāo)志物

3、。Rv2657c是MTB處于營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)上調(diào)表達(dá)的蛋白，其編碼基因位于MTB與卡介菌(M.bovis Bacille Calmette-Guerin，BCG)基因組的差異區(qū)(region of difference，RD)。Rv2657c蛋白由86個(gè)氨基酸組成，基因長(zhǎng)度為261bp，相對(duì)分子質(zhì)量為9506.8Da，等電點(diǎn)為9.2211，分泌可能的phirv2噬菌體蛋白，功能未知。本研究應(yīng)用DNAStar軟件預(yù)測(cè)Rv2657c蛋白的T細(xì)

4、胞和B細(xì)胞表位;應(yīng)用Blast方法分析該蛋白氨基酸序列與人類蛋白序列的相似性;分別用BIMAS量化基序法、NetCTL法和SYFPEITHI超基序法預(yù)測(cè)蛋白的CTL表位;分別用SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)Th細(xì)胞表位，從中篩選表位較集中、得分較高者作為候選多肽片段。應(yīng)用TMHMM軟件對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)，使用PSORT version軟件進(jìn)行蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位，應(yīng)用SignalP軟件2.0和SignalP4.0Ser

5、ver進(jìn)行信號(hào)肽分析。構(gòu)建表達(dá)Rv2657c重組蛋白(rRv2657c)的大腸桿菌(E.coli)工程菌，然后誘導(dǎo)rRv2657c蛋白表達(dá)，繼而純化rRv2657c蛋白。通過(guò)蛋白免疫印記法(Western blot)及酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)方法初步研究其免疫學(xué)特性，其中ELISPOT檢測(cè)，以早期增殖期蛋白---培養(yǎng)濾過(guò)蛋白10和早期分泌抗原靶6重組融合蛋白(CFP10

6、-ESAT6，CE)為對(duì)照，以rRv2657c刺激健康防癆工作人群和活動(dòng)性結(jié)核病人群的外周血單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)分泌γ干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)(SFCs)，比較其在不同人群里的差別。
　　Protean軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明Rv2657c蛋白親水性、柔韌性及抗原性較好，表面可及性較弱，α螺旋和β折疊數(shù)量較多且分布范圍廣泛，卷曲、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)少，有5個(gè)B細(xì)胞表位，表位總長(zhǎng)度占蛋白氨基酸全長(zhǎng)的50％，主要集中在第14位氨基酸之后;預(yù)測(cè)該蛋白有6

7、個(gè)T細(xì)胞表位，表位總長(zhǎng)度占蛋白氨基酸全長(zhǎng)的38.4％，主要集中在第10位氨基酸之后。BIMAS量化基序法、NetCTL法、和SYFPEITHI超基序法預(yù)測(cè)該蛋白有6個(gè)CTL表位，其中以HLA-A2限制性表位數(shù)目較多，得分較高;SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法預(yù)測(cè)該蛋白有38個(gè)Th表位，其中以HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701表型表位數(shù)目較多。TMHMM軟件、PSORT version軟件、SignalP軟

8、件2.0和SignalP4.0Server預(yù)測(cè)Rv2657c蛋白是一個(gè)無(wú)信號(hào)肽，不分泌的胞漿蛋白。成功構(gòu)建了表達(dá)rRv2657c蛋白的E.coli工程菌，并獲得了純化的蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rRv2657c蛋白與結(jié)核潛伏感染豚鼠血清反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，健康對(duì)照組反應(yīng)結(jié)果為陰性。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rRv2657c蛋白在健康防癆工作人員組的SFCs值(11)明顯高于活動(dòng)性結(jié)核病組(1.5)(p＜0.05)。