多態(tài)性人細(xì)胞色素酶P450 2D6異源表達(dá)系統(tǒng)的建立及其在藥物篩選中的初步應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞色素P450同工酶屬于血紅蛋白超家族，是參與眾多外源物和內(nèi)源物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的重要酶系，主要存在于肝臟中。其中CYP1、2、3家族負(fù)責(zé)大多數(shù)外源物的代謝，具有廣泛的底物特異性。人CYP2D6參與代謝大量的處方藥。藥物遺傳學(xué)研究表明，該酶基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可引起藥物代謝的改變。本實(shí)驗(yàn)選取8個(gè)天然存在的SNPs，以研究單個(gè)氨基酸替換對(duì)CYP2D6生化性質(zhì)和藥物代謝的影響。 選擇適合酵母表達(dá)體系的載體pYES2/CT進(jìn)

2、行基因克隆，利用PCR定點(diǎn)突變方法在原型2D6基因中引入SNPs。測(cè)序后，用半乳糖誘導(dǎo)重組子在整合有POR基因的酵母系統(tǒng)中表達(dá)；用差速離心法制備含CYP2D6重組酶的S9微粒體。采用CYP2D6特異性熒光底物AMMC進(jìn)行酶催化活性和動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)可用非線性回歸分析法計(jì)算Km值和Vmax值；利用該系統(tǒng)還檢測(cè)了5大類12種常用臨床藥物對(duì)CYP2D6原型及突變型的不同抑制常數(shù)。 經(jīng)Western Blot驗(yàn)證，半乳糖誘導(dǎo)的

3、CYP2D6原型和8株SNPs在酵母系統(tǒng)均獲得高表達(dá)。微粒體熒光檢測(cè)結(jié)果顯示， CYP2D6原型具有較強(qiáng)催化活性，Km值為2.9μmol/L，Vmax值為17.1RFU/min/mg微粒體蛋白。在8個(gè)SNP中，L213P和1369T完全失活，而P34S的活性顯著降低，它的Km值是CYP2D6原型的3倍。A85V的活性略有增強(qiáng)，其Km值約為CYP2D6原型的一半。其余各株均保持與原型近似的Km值。藥物抑制實(shí)驗(yàn)IC50值顯示，CYP2D6原

4、型和突變株都被其特異性抑制劑奎尼丁強(qiáng)烈抑制。盡管各類藥物對(duì)CYP2D6原型和突變體蛋白的抑制趨勢(shì)大體一致，但針對(duì)某一種藥物的具體抑制情況，CYP2D6多念性現(xiàn)象依然存在；而且同類不同種藥物對(duì)同一SNP的抑制程度也不一樣。 現(xiàn)已獲得8種天然存在的單核苷酸多態(tài)性人CYP2D6酶，且它們的生化性質(zhì)均已得到驗(yàn)證。這些突變株在酶動(dòng)力學(xué)特征方面與野生型有明顯的區(qū)別。已針對(duì)CYP2D6原型和突變型進(jìn)行了12種藥物的篩選，不同藥物、不同SNP的