從炎癥的角度研究FLZ防治神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制及胞壁酰二肽衍生物MDP-C免疫活性研究.pdf

1、本論文包括兩部分內(nèi)容，第一部分：從炎癥的角度研究FLZ防治神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制。第二部分：胞壁酰二肽衍生物MDP—C免疫活性研究 第一部分：從炎癥的角度研究FLZ防治神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制 FLZ是一種人工合成的番荔枝酰胺衍生物，以往研究顯示具有很強(qiáng)的抗氧化、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用，對多種實驗性帕金森氏病動物模型的運(yùn)動障礙和實驗性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙都具有改善作用。炎癥在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中起重要的作用，可

2、能是其誘發(fā)因素之一，控制疾病過程中的炎癥反應(yīng)，有益于神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防與治療。因此，本研究從炎癥的角度對FLZ防治神經(jīng)退行性疾病的作用及作用機(jī)理進(jìn)行了研究。 一、FLZ對側(cè)腦室注射LPS小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及相關(guān)抗炎作用研究 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，是一種強(qiáng)的炎癥刺激物，可引起動物學(xué)習(xí)記憶障礙，神經(jīng)元發(fā)生損傷，可以較好的模擬阿爾茨海默病(Alzheim

3、er's disease，AD)腦內(nèi)炎癥的改變。我們的研究結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射LPS(2.5μg/只)小鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)出了學(xué)習(xí)記憶能力的障礙，給予FLZ(150 mg/kg、75mg/kg)可明顯改善動物的學(xué)習(xí)記憶能力。病理和尼氏染色結(jié)果顯示FLZ對LPS引起的海馬神經(jīng)元的損傷具有明顯的保護(hù)作用。生化檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)LZ能降低海馬內(nèi)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介

4、素1β(Interleukin1β，IL-1β)，并降低LPS引起的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性的升高。免疫組化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLZ能抑制LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，對LPS誘導(dǎo)的iNOS、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase—2，Cox—2)的表達(dá)有明顯的抑制作用，實驗還觀察了炎癥狀態(tài)下與AD密切相關(guān)的β—淀粉樣蛋白(β—amyloid，Aβ

5、)和β—分泌酶(β—Secretase，BACE1)的變化，結(jié)果顯示，LPS刺激可以促進(jìn)BACE1的表達(dá)，并增加Aβ的產(chǎn)生，F(xiàn)LZ對此有明顯的抑制作用。本部分實驗結(jié)果提示FLZ能顯著抑制LPS側(cè)腦室注射引起的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少神經(jīng)毒性炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并顯著改善炎癥反應(yīng)引起的學(xué)習(xí)記憶障礙和神經(jīng)元損傷。 二、FLZ對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究 上部分研究內(nèi)容提示FLZ能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形

6、膠質(zhì)細(xì)胞的活化、減少神經(jīng)毒性炎癥介質(zhì)的分泌從而改善炎癥反應(yīng)引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，我們應(yīng)用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株，檢測了FLZ對LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)一氧化氮(Nitric oxide，NO)的釋放，TNF-α的產(chǎn)生，以及iNOS、TNF-α和Cox—2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)LZ在1、5、10μM劑量明顯抑制LPS引起的NO的產(chǎn)生和iNOS、Cox—2 mRNA的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，在10μM劑量，顯著減少T

7、NF-α的分泌，對TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄也有抑制，此外FLZ對LPS和聚集態(tài)Aβ1—40誘導(dǎo)BV—2小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞株釋放的炎癥介質(zhì)NO和TNF-α也有明顯的抑制作用。隨后我們從核轉(zhuǎn)錄因子B(Nuclear factor—kappa B，NF—κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen—activated protein kinase，MAPK)信號通路探討了FLZ抗炎作用機(jī)制，F(xiàn)LZ對LPS引起的IκB激酶(IκB kinase，

8、IKK)和抑制性κB(InhibitoryκB，IκB)的磷酸化、IκB的降解、NF—κB的轉(zhuǎn)位入核及NF—κB與特異DNA序列的結(jié)合均有明顯抑制作用。對轉(zhuǎn)錄因子(Activator protein1，AP—1)與特異DNA序列的結(jié)合、c—Jun氨基末端激酶(c—Jun NH2-Terminal kinase，JNK)與p38的磷酸化也有顯著的抑制作用，但對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated

9、 kinase，ERK)的磷酸化沒有明顯的影響。TGF-β活化激酶1(Transforming growth factor-β activatedkinase1，TAK1)是IKK和JNK、p38的上游激酶，F(xiàn)LZ能劑量依賴性的抑制TAK1的磷酸化。此外，F(xiàn)LZ對LPS和H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)有明顯的抑制作用。以上結(jié)果提示FLZ對LPS引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，這種作用可能與

10、其抑制LPS引起的TAK1—IKK—NF—κB信號通路和TAK1—JNK/p38MAPK/AP—1信號通路活化的抑制有關(guān)，此外，F(xiàn)LZ對ROS的抑制可能也是其抗炎作用的重要機(jī)制之一。 綜上所述，F(xiàn)LZ能顯著抑制小鼠側(cè)腦室注射LPS引起的炎癥反應(yīng)，對LPS引起的學(xué)習(xí)記憶障礙和神經(jīng)元損傷有明顯的改善作用。FLZ對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與其抑制TAK1—IKK—NF—κB信號通路和TAK1—JNK/p38MAPK—AP—1

11、信號通路有關(guān)，對ROS的抑制作用也參與其中。對炎癥反應(yīng)的抑制作用可能是FLZ防治神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制之一。 第二部分：胞壁酰二肽衍生物MDP—C免疫活性研究 N—乙酰胞壁酸—L—丙氨酸—D—異谷胺酰胺，簡稱胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)，是分枝桿菌細(xì)胞壁中具有免疫佐劑活性的最小的結(jié)構(gòu)單位，具有廣泛的生物學(xué)活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體對感染和腫瘤的非特異抵抗力。但是MDP難以穿透

12、細(xì)胞膜，在體內(nèi)迅速消除，以及體內(nèi)實驗可以引起發(fā)熱、嗜睡、厭食和新陳代謝亢進(jìn)等不良反應(yīng)影響了其應(yīng)用。因此，對MDP進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成活性好的結(jié)構(gòu)類似物做為疫苗的佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑用于感染和腫瘤的治療成為藥物研究領(lǐng)域內(nèi)的一項重要課題。 N2—[a—O—芐基—N—(乙酰胞壁酰)—L—丙胺酰—D—異谷胺酰胺?！狽6—反式—(間—硝基肉桂?；?—L賴胺酸酰胺簡稱MDP—C，是一種新合成的MDP衍生物。以往的研究顯示MDP—C是一個潛在的免

13、疫增強(qiáng)劑，本研究進(jìn)一步觀察了MDP—C的免疫活性，并對其在腫瘤免疫治療方面的應(yīng)用價值進(jìn)行了初步探討。 首先應(yīng)用小鼠Lewis肺癌模型檢測了MDP—C對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有無抑制作用，結(jié)果顯示MDP—C單獨應(yīng)用對小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤和肺轉(zhuǎn)移都沒有明顯的影響，MDP—C1.25 mg/kg、2.5 mg/kg劑量與低劑量(15 mg/kg)異環(huán)磷酰胺合用時，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)減少，但是與正常對照組相比沒有明顯的差異。隨后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點

14、分析(Enzyme—linked immunospot assay，ELISPOT)方法檢測了MDP—C對CTL表位多肽TRP—2180-188誘導(dǎo)小鼠特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化產(chǎn)生IFN—γ的佐劑作用，結(jié)果顯示，MDP—C與TRP—2180-188多肽合用，在一定程度上增強(qiáng)了TRP—2180-188多肽誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)，但是作用較弱，統(tǒng)計學(xué)差異不顯著。 樹突細(xì)胞(Den

15、dritic cells，DCs)是重要的專職抗原提呈細(xì)胞，在啟動機(jī)體特異性、非特異性免疫應(yīng)答的過程中起著關(guān)鍵的作用。促使DCs成熟，增強(qiáng)其抗原提呈功能是佐劑作用的重要機(jī)制。本研究在體外應(yīng)用人單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(Monocyte derived dendritic cells，MoDCs)探討了MDP—C對樹突細(xì)胞成熟和功能的影響。經(jīng)重組人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM—CSF，1000U/ml)和重組人白細(xì)胞介素—4(rh

16、IL—4，500U/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法得到了不成熟樹突細(xì)胞(iDCs)，iDCs在含有MDP—C的完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用流式細(xì)胞儀檢測MoDCs表型，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL—6、IL-12(p40+70)濃度，以MoDCs為刺激細(xì)胞，異體同種T淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞觀察MDP—C對MoDCs抗原提呈和淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，10μM MDP—C能顯著增加MoDCs細(xì)胞表面HLA—DR、C

17、D80、CD86以及CD83的表達(dá)，并能夠增強(qiáng)MoDCs刺激異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力，但是MDP—C不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL—6、IL-12(p40+70)的產(chǎn)生，而陽性對照藥Romurtide1μM劑量對上述表面分子和細(xì)胞因子均有明顯的誘導(dǎo)作用。隨后我們應(yīng)用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系檢測了MDP—C對TNF-α有無作用，結(jié)果顯示，經(jīng)1μM MDP刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力明顯增強(qiáng)，而MDP—C

18、各劑量組對兩種巨噬細(xì)胞均未表現(xiàn)出增強(qiáng)作用。 綜合本部分研究，MDP—C在體內(nèi)對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移均未顯示明顯的治療作用，對多肽引起的CTL活化也未顯示明顯的增強(qiáng)。體外實驗中MDP—C能夠促進(jìn)MoDCs表面分子HLA—DR、CD80、CD86以及CD83的表達(dá)，增強(qiáng)抗原提呈功能，但是不能誘導(dǎo)MoDCs產(chǎn)生細(xì)胞因子IL—6、IL-12(p40+70)，也不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。提示，MDP—C有一定的免疫增強(qiáng)活