從炎癥的角度研究FLZ防治神經退行性疾病的作用機制及胞壁酰二肽衍生物MDP-C免疫活性研究.pdf

1、本論文包括兩部分內容，第一部分：從炎癥的角度研究FLZ防治神經退行性疾病的作用機制。第二部分：胞壁酰二肽衍生物MDP—C免疫活性研究 第一部分：從炎癥的角度研究FLZ防治神經退行性疾病的作用機制 FLZ是一種人工合成的番荔枝酰胺衍生物，以往研究顯示具有很強的抗氧化、抗凋亡和神經保護作用，對多種實驗性帕金森氏病動物模型的運動障礙和實驗性癡呆小鼠的學習記憶障礙都具有改善作用。炎癥在神經退行性疾病的發(fā)病過程中起重要的作用，可

2、能是其誘發(fā)因素之一，控制疾病過程中的炎癥反應，有益于神經退行性疾病的預防與治療。因此，本研究從炎癥的角度對FLZ防治神經退行性疾病的作用及作用機理進行了研究。 一、FLZ對側腦室注射LPS小鼠學習記憶能力的影響及相關抗炎作用研究 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞膜的結構成分，是一種強的炎癥刺激物，可引起動物學習記憶障礙，神經元發(fā)生損傷，可以較好的模擬阿爾茨海默病(Alzheim

3、er's disease，AD)腦內炎癥的改變。我們的研究結果顯示，側腦室注射LPS(2.5μg/只)小鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)出了學習記憶能力的障礙，給予FLZ(150 mg/kg、75mg/kg)可明顯改善動物的學習記憶能力。病理和尼氏染色結果顯示FLZ對LPS引起的海馬神經元的損傷具有明顯的保護作用。生化檢測結果顯示，F(xiàn)LZ能降低海馬內LPS誘導產生的腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介

4、素1β(Interleukin1β，IL-1β)，并降低LPS引起的誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性的升高。免疫組化實驗結果發(fā)現(xiàn)FLZ能抑制LPS引起的小膠質細胞和星形膠質細胞的活化和增殖，對LPS誘導的iNOS、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase—2，Cox—2)的表達有明顯的抑制作用，實驗還觀察了炎癥狀態(tài)下與AD密切相關的β—淀粉樣蛋白(β—amyloid，Aβ

5、)和β—分泌酶(β—Secretase，BACE1)的變化，結果顯示，LPS刺激可以促進BACE1的表達，并增加Aβ的產生，F(xiàn)LZ對此有明顯的抑制作用。本部分實驗結果提示FLZ能顯著抑制LPS側腦室注射引起的小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，減少神經毒性炎癥介質的產生，并顯著改善炎癥反應引起的學習記憶障礙和神經元損傷。 二、FLZ對巨噬細胞炎癥反應的抑制作用及相關機制研究 上部分研究內容提示FLZ能通過抑制小膠質細胞和星形

6、膠質細胞的活化、減少神經毒性炎癥介質的分泌從而改善炎癥反應引起的小鼠學習記憶障礙。為進一步探討其作用機制，我們應用RAW264.7小鼠巨噬細胞株，檢測了FLZ對LPS誘導的炎癥介質一氧化氮(Nitric oxide，NO)的釋放，TNF-α的產生，以及iNOS、TNF-α和Cox—2表達的影響。結果顯示，F(xiàn)LZ在1、5、10μM劑量明顯抑制LPS引起的NO的產生和iNOS、Cox—2 mRNA的轉錄與蛋白表達，在10μM劑量，顯著減少T

7、NF-α的分泌，對TNF-α mRNA的轉錄也有抑制，此外FLZ對LPS和聚集態(tài)Aβ1—40誘導BV—2小鼠小膠質瘤細胞株釋放的炎癥介質NO和TNF-α也有明顯的抑制作用。隨后我們從核轉錄因子B(Nuclear factor—kappa B，NF—κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen—activated protein kinase，MAPK)信號通路探討了FLZ抗炎作用機制，F(xiàn)LZ對LPS引起的IκB激酶(IκB kinase，

8、IKK)和抑制性κB(InhibitoryκB，IκB)的磷酸化、IκB的降解、NF—κB的轉位入核及NF—κB與特異DNA序列的結合均有明顯抑制作用。對轉錄因子(Activator protein1，AP—1)與特異DNA序列的結合、c—Jun氨基末端激酶(c—Jun NH2-Terminal kinase，JNK)與p38的磷酸化也有顯著的抑制作用，但對細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellular signal regulated

9、 kinase，ERK)的磷酸化沒有明顯的影響。TGF-β活化激酶1(Transforming growth factor-β activatedkinase1，TAK1)是IKK和JNK、p38的上游激酶，F(xiàn)LZ能劑量依賴性的抑制TAK1的磷酸化。此外，F(xiàn)LZ對LPS和H2O2誘導產生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)有明顯的抑制作用。以上結果提示FLZ對LPS引起的炎癥反應具有抑制作用，這種作用可能與

10、其抑制LPS引起的TAK1—IKK—NF—κB信號通路和TAK1—JNK/p38MAPK/AP—1信號通路活化的抑制有關，此外，F(xiàn)LZ對ROS的抑制可能也是其抗炎作用的重要機制之一。 綜上所述，F(xiàn)LZ能顯著抑制小鼠側腦室注射LPS引起的炎癥反應，對LPS引起的學習記憶障礙和神經元損傷有明顯的改善作用。FLZ對LPS誘導的炎癥反應的抑制作用可能與其抑制TAK1—IKK—NF—κB信號通路和TAK1—JNK/p38MAPK—AP—1

11、信號通路有關，對ROS的抑制作用也參與其中。對炎癥反應的抑制作用可能是FLZ防治神經退行性疾病的機制之一。 第二部分：胞壁酰二肽衍生物MDP—C免疫活性研究 N—乙酰胞壁酸—L—丙氨酸—D—異谷胺酰胺，簡稱胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)，是分枝桿菌細胞壁中具有免疫佐劑活性的最小的結構單位，具有廣泛的生物學活性，可以作為免疫調節(jié)劑在一定程度上增強機體對感染和腫瘤的非特異抵抗力。但是MDP難以穿透

12、細胞膜，在體內迅速消除，以及體內實驗可以引起發(fā)熱、嗜睡、厭食和新陳代謝亢進等不良反應影響了其應用。因此，對MDP進行結構改造，合成活性好的結構類似物做為疫苗的佐劑或免疫調節(jié)劑用于感染和腫瘤的治療成為藥物研究領域內的一項重要課題。 N2—[a—O—芐基—N—(乙酰胞壁酰)—L—丙胺?！狣—異谷胺酰胺?！狽6—反式—(間—硝基肉桂?；?—L賴胺酸酰胺簡稱MDP—C，是一種新合成的MDP衍生物。以往的研究顯示MDP—C是一個潛在的免

13、疫增強劑，本研究進一步觀察了MDP—C的免疫活性，并對其在腫瘤免疫治療方面的應用價值進行了初步探討。 首先應用小鼠Lewis肺癌模型檢測了MDP—C對腫瘤生長和轉移有無抑制作用，結果顯示MDP—C單獨應用對小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤和肺轉移都沒有明顯的影響，MDP—C1.25 mg/kg、2.5 mg/kg劑量與低劑量(15 mg/kg)異環(huán)磷酰胺合用時，肺轉移結節(jié)數(shù)減少，但是與正常對照組相比沒有明顯的差異。隨后，應用酶聯(lián)免疫斑點

14、分析(Enzyme—linked immunospot assay，ELISPOT)方法檢測了MDP—C對CTL表位多肽TRP—2180-188誘導小鼠特異性細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化產生IFN—γ的佐劑作用，結果顯示，MDP—C與TRP—2180-188多肽合用，在一定程度上增強了TRP—2180-188多肽誘導的CTL反應，但是作用較弱，統(tǒng)計學差異不顯著。 樹突細胞(Den

15、dritic cells，DCs)是重要的專職抗原提呈細胞，在啟動機體特異性、非特異性免疫應答的過程中起著關鍵的作用。促使DCs成熟，增強其抗原提呈功能是佐劑作用的重要機制。本研究在體外應用人單核細胞來源的樹突細胞(Monocyte derived dendritic cells，MoDCs)探討了MDP—C對樹突細胞成熟和功能的影響。經重組人粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(rhGM—CSF，1000U/ml)和重組人白細胞介素—4(rh

16、IL—4，500U/ml)誘導培養(yǎng)的方法得到了不成熟樹突細胞(iDCs)，iDCs在含有MDP—C的完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用流式細胞儀檢測MoDCs表型，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細胞因子IL—6、IL-12(p40+70)濃度，以MoDCs為刺激細胞，異體同種T淋巴細胞為效應細胞觀察MDP—C對MoDCs抗原提呈和淋巴細胞增殖的影響。結果顯示，與溶劑對照組相比，10μM MDP—C能顯著增加MoDCs細胞表面HLA—DR、C

17、D80、CD86以及CD83的表達，并能夠增強MoDCs刺激異體T淋巴細胞增殖的能力，但是MDP—C不能誘導細胞因子IL—6、IL-12(p40+70)的產生，而陽性對照藥Romurtide1μM劑量對上述表面分子和細胞因子均有明顯的誘導作用。隨后我們應用RAW264.7小鼠巨噬細胞系檢測了MDP—C對TNF-α有無作用，結果顯示，經1μM MDP刺激的RAW264.7巨噬細胞和小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的能力明顯增強，而MDP—C

18、各劑量組對兩種巨噬細胞均未表現(xiàn)出增強作用。 綜合本部分研究，MDP—C在體內對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長和轉移均未顯示明顯的治療作用，對多肽引起的CTL活化也未顯示明顯的增強。體外實驗中MDP—C能夠促進MoDCs表面分子HLA—DR、CD80、CD86以及CD83的表達，增強抗原提呈功能，但是不能誘導MoDCs產生細胞因子IL—6、IL-12(p40+70)，也不能誘導巨噬細胞產生TNF-α。提示，MDP—C有一定的免疫增強活