白蟻菌圃及中藥等對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療機(jī)制及效果的研究.pdf

1、背景和目的：
　　神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一組由慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)組織退行性變性而產(chǎn)生的疾病總稱，它包括:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、亨廷頓病(Huntington disease，HD)、帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)等。迄今

2、為止，此類疾病的發(fā)病病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，隨著老齡化社會(huì)的來臨，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中AD和PD患病率呈逐年上升趨勢(shì)，雖然其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不能明確，但有研究表明，AD和PD的發(fā)生發(fā)展有著共同的氧化應(yīng)激損傷通道，從而造成生物大分子物質(zhì)氧化損傷，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激在AD、PD發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療方面，傳統(tǒng)的藥物治療方法，副作用大，費(fèi)用高，易產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期服藥效果下降，近年來，大量的

3、研究證明，很多中藥均有清除自由基的功效，能夠抑制氧化應(yīng)激所帶來的一系列的損傷及其繼發(fā)的細(xì)胞凋亡，尤其在治療AD、PD方面取得了顯著的成績(jī)，今后中藥在阻止或延緩AD、PD發(fā)生、發(fā)展，以及預(yù)防和治療AD、PD中會(huì)起著一定的積極作用。
　　本研究旨在研究和探討白蟻菌圃及中藥等，其抗氧化、治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的機(jī)制和效果，為開發(fā)新的治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物提供理論依據(jù)。
　　研究方法
　　1.利用N-甲基-4-苯基-1，

4、2，3，6-四氫吡啶(MPTP)給大鼠腹腔注射，再用爬桿法進(jìn)行篩選，選取PD模型大鼠隨機(jī)抽取治療組及對(duì)照組，由黃芪、天麻、銀杏葉、白芍、鉤藤、連翹、生甘草、野生葛根、大葉紅景天、黃連等配成中藥平顫方，聯(lián)合褪黑素(MT)給予模型組及對(duì)照組進(jìn)行治療21d，觀察大鼠的行為學(xué)及腦切片，分別用H-E染色，Bax/Bcl-2免疫組織化學(xué)染色和TUNEL法細(xì)胞凋亡染色，對(duì)腦勻漿進(jìn)行多巴胺(dopamine，DA)及高香草酸(homovanillic

5、acid，HVA)和二羥基苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)的測(cè)定。
　　2.利用野生型果蠅(UAS-wild-typeα-synuclein/+)及UAS-DdC果蠅雜交得到PD果蠅，以野生型果蠅為對(duì)照組和PD果蠅作為研究組，給予不同濃度的白蟻菌圃醇提液培養(yǎng)42d，并對(duì)培養(yǎng)前后PD果蠅的行為學(xué)及壽命進(jìn)行分析、對(duì)果蠅腦組織病理切片蘇木精-伊紅(HE)染色后觀察。
　　3.利用D-半

6、乳糖持續(xù)皮下注射建立小鼠AD模型的，作為實(shí)驗(yàn)組，正常小鼠作為對(duì)照組，采用Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，分別從四個(gè)象限將小鼠放入水池中，計(jì)算潛伏期平均值，以評(píng)價(jià)小鼠空間記憶的獲得能力，并對(duì)模型實(shí)驗(yàn)組小鼠血液進(jìn)行過氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定，評(píng)價(jià)造模是否成功，給予模型組小鼠喂食不同濃度的白蟻菌圃醇提液，同時(shí)測(cè)定AD模型治療組小鼠血液的SOD，MDA和GSH水平，評(píng)價(jià)不同濃度白蟻菌圃醇提液對(duì)AD小鼠的

7、治療效果，并分別觀察比較AD模型組與治療組的小鼠腦部β-淀粉樣蛋白表達(dá)、腦組織和肝組織病理學(xué)改變。
　　4.白蟻菌圃醇提液對(duì)抗SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用的研究，用H2O2建立人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y氧化應(yīng)激損傷模型，MTT法測(cè)不同時(shí)間段的細(xì)胞存活率，同時(shí)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液用于檢測(cè)SOD、MDA和GSH，在造模同時(shí)和造模后加入不同濃度的白蟻菌圃醇提取液，觀察其對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)防及治療作用。
　　

8、5.白蟻菌圃水提液對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，應(yīng)用白蟻菌圃水提液與BGC-823細(xì)胞作用24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)細(xì)胞存活率，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BGC-823細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并行細(xì)胞總RNA的提取，cDNA逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增。
　　結(jié)果
　　1.MPTP復(fù)制的PD動(dòng)物模型，其前腦組織DA、HVA、DOPA

9、C含量與空白對(duì)照組相比，均顯著降低，同時(shí)伴隨有智力減退和運(yùn)動(dòng)障礙;使用中藥平顫方+MT治療21 d，模型組中DA、HVA、DOPAC含量均較病理對(duì)照組明顯增加;給予中藥平顫方聯(lián)合MT治療PD，大鼠前腦紋狀體神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2基因蛋白的表達(dá)明顯增多、增強(qiáng)，Bax基因表達(dá)受到抑制，同時(shí)DA細(xì)胞凋亡減少。
　　2.與對(duì)照組相比，PD雄性果蠅的攀爬能力隨年齡成熟而增強(qiáng)，但在羽化后的24到48 d，下降較明顯。在白蟻菌圃實(shí)驗(yàn)組中，白

10、蟻菌圃干預(yù)并起作用的時(shí)間和濃度相關(guān)，在雌性果蠅中，PD果蠅的攀爬能力隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸降低，不同濃度的白蟻菌圃培養(yǎng)都能提高PD果蠅的攀爬能力，在羽化后18到48 d最顯著，且隨濃度及果蠅年齡的增長(zhǎng)，效果更好，雌雄PD果蠅之間攀爬能力無明顯差異，且用含不同濃度的白蟻菌圃醇提液培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅壽命明顯延長(zhǎng)，呈現(xiàn)了較好的劑量依賴性關(guān)系。取攀爬能力下降較明顯的第36 d的果蠅，制作病理切片，經(jīng)HE染色的病理切片可見，與對(duì)照組相比，PD果蠅的腦

11、組織邊緣皮質(zhì)層細(xì)胞變薄、排列紊亂，空泡增多，添食了白蟻菌圃提取物的果蠅腦組織中，細(xì)胞數(shù)目增多，排列較緊密有序，空泡減少。
　　3.在AD衰老模型組迷宮試驗(yàn)中，小鼠體力、智力下降，逃避潛伏期延長(zhǎng)明顯，其氧化和抗氧化指標(biāo)明顯改變，且AD模型組腦部改變與衰老的生理變化相符合，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，證明造模成功。治療組中，小鼠血液SOD活力、GSH含量、MDA含量較模型組有明顯改善，不同濃度白蟻菌圃治療后AD模型組腦細(xì)胞、肝細(xì)胞中，細(xì)胞形態(tài)

12、隨著藥物治療濃度的增加，絕大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)逐漸接近正常，且治療組腦組織絕大多數(shù)細(xì)胞中，β-淀粉樣蛋白表達(dá)逐漸接近正常組小鼠腦組織。
　　4.在神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入不同劑量的白蟻菌圃醇提液，通過SOD、MDA及GSH測(cè)定結(jié)果表明，白蟻菌圃醇提液預(yù)先處理細(xì)胞，可以對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，存活率提高，表明白蟻菌圃醇提取液可以對(duì)抗H2O2造成的損傷。
　　5.白蟻菌圃水提液與胃癌細(xì)胞系BGC

13、-823細(xì)胞作用24 h后，結(jié)果顯示，加藥后BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)都發(fā)生了改變，細(xì)胞數(shù)目減少，部分細(xì)胞破裂，另有部分細(xì)胞的核皺縮，核漿變少等，表明白蟻菌圃水提液能破壞和抑制BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)BGC-823細(xì)胞的存活率有較大影響，細(xì)胞的存活率與濃度呈負(fù)性相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)白蟻菌圃提取物可以引起p53基因表達(dá)的上調(diào)，但其機(jī)理有待研究。
　　結(jié)論
　　1.MPTP注射建模顯示，模型組絕大多數(shù)小鼠鼠

14、須脫落明顯，毛色逐漸失去光澤，易脫落，皮膚彈性差，呈現(xiàn)出衰老體征，表明AD模型成功建立，中藥副作用小，可以和西藥配伍，從而增加治療的效果減少耐藥性，模型實(shí)驗(yàn)組中藥治療后，衰老癥狀、行為學(xué)及腦部組織病變等均有改善，褪黑激素分子小，作用部位廣泛，以其高彌散的穿透能力發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，通過提高腦的抗氧化能力，防止腦組織免受自身氧化應(yīng)激損傷。中西藥二者聯(lián)合使用，有機(jī)聯(lián)系辨證論治的統(tǒng)一性和證候之間的關(guān)系，為探索中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療PD的優(yōu)勢(shì)及其作用

15、機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
　　2.果蠅具有高度發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)、較短的生命周期，并且易于進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)研究的操作和分析，是一個(gè)非常穩(wěn)定而實(shí)用的模式生物，果蠅PD模型能夠很好的模擬人類PD的慢性退行性改變。白蟻菌圃對(duì)PD果蠅的攀爬能力及壽命有較明顯的改善，且呈現(xiàn)較好的濃度和時(shí)間依賴性，雌性和雄性之間無明顯差異，經(jīng)白蟻菌圃治療后的PD果蠅，其腦組織邊緣皮質(zhì)層細(xì)胞較PD模型組增多，且排列整齊，腦組織內(nèi)的空泡減少，此改變與果

16、蠅的攀爬能力和壽命的改變相一致，由此可以證明白蟻菌圃可以改善PD的運(yùn)動(dòng)障礙，可能與白蟻菌圃抗氧化作用相關(guān)，其神經(jīng)保護(hù)作用及抗PD的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究，因其較強(qiáng)的抗氧化作用，白蟻菌圃有望發(fā)展成為一種預(yù)防和治療PD的新型藥物。
　　3.在實(shí)驗(yàn)中，利用D-半乳糖持續(xù)皮下注射建立小鼠AD模型可靠，經(jīng)不同濃度白蟻菌圃治療后，氧化抗氧化指標(biāo)及肝組織、腦組織形態(tài)改變、腦組織中β-淀粉樣蛋白表達(dá)減少，隨著治療濃度的增加，改變呈現(xiàn)濃度依賴性，

17、顯示高濃度治療劑量效果更佳，說明白蟻菌圃具有抗AD的作用。
　　4.以H2O2體外誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的模型，可以比較直觀地分析抗氧化劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，預(yù)先加入白蟻菌圃醇提取液處理細(xì)胞，說明白蟻菌圃醇提取液具有一定的預(yù)防H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。當(dāng)白蟻菌圃醇提取液與H2O2同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的存活率比H2O2損傷對(duì)照組仍有提高，并與劑量呈正向趨勢(shì)，說明在白蟻菌圃醇提取液中存在抗氧化的物質(zhì)，推論白蟻菌圃具