TRPM7在壓力超負荷下小鼠心肌纖維化形成中的作用.pdf

1、高血壓(Hypertension)是最常見的心血管疾病，由于發(fā)病率較高已成為全球范圍重要的公共健康問題。長期高血壓的患者會發(fā)生代償性的心肌肥厚(Cardiachypertrophy)，最終導(dǎo)致心功能障礙和心力衰竭，其發(fā)生與心肌重構(gòu)(Myocardialremodeling，MR)密切相關(guān)。臨床觀察和實驗室研究證明，心肌纖維化(Myocardialfibrosis)是心肌重構(gòu)的重要病理表現(xiàn)之一，也是造成心力衰竭的主要原因。因此，明確心肌纖

2、維化的發(fā)生機制，將有利于尋找新的治療靶點，對臨床防治心臟疾病具有重要意義。
　　 心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纖維化產(chǎn)生的細胞學(xué)基礎(chǔ)。在某些病理因素如心肌損傷、缺氧應(yīng)激、機械牽拉、炎性刺激等作用下，心肌成纖維細胞會過度增殖、遷移和發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，分化成為肌纖維母細胞(Myofibroblasts，MFB)。肌纖維母細胞通過分泌細胞外基質(zhì)蛋白(Extracellular-matrix，ECM

3、)、生長因子、細胞介素、趨化因子和蛋白酶等，對纖維化的形成起著重要作用。然而，關(guān)于調(diào)控心肌成纖維細胞分化，進而促進纖維化形成的分子機制還不清楚。
　　 Ca2+信號參與細胞的多種功能，包括細胞的增殖、分化、基因表達、細胞的凋亡等。研究表明，在心肌成纖維細胞上并不存在功能性電壓依賴性Ca2+離子通道，這與其靜息膜電位(-20 mV)下電壓門控離子通道處于失活狀態(tài)有關(guān)，提示非電壓門控的Ca2+通道可能對心肌成纖維細胞的生理功能起主導(dǎo)

4、作用。瞬時感受器電位(Transient receptor potential，TRP)通道是近年來發(fā)現(xiàn)的非電壓門控性離子通道，能被多種刺激所激活，包括氧化應(yīng)激、機械牽拉、細胞代謝產(chǎn)物、熱刺激等。TRPM7(Transient receptor potential melastatin related7)通道是TRP家族成員之一，廣泛存在于機體的組織器官中，參與細胞的增殖和分化、運動和遷移、胚胎的發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細胞的凋亡等。最近

5、的研究發(fā)現(xiàn)，在人類心房肌成纖維細胞上，TRPM7通道是對Ca2+通透的主要的功能性離子通道，并且參與心房肌成纖維細胞的增殖、分化和膠原的生成。由此我們推測，TRPM7可能參與心肌成纖維細胞的促纖維化作用。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor beta-1，TGF-β1)是體內(nèi)促進心肌纖維化的重要細胞因子之一，研究表明，TGF-β1具有促進心肌成纖維細胞向肌纖維母細胞分化、促進膠原基因表

6、達、ECM合成與沉積等作用。而細胞內(nèi)Ca2+信號是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的第二信使，使用Ca2+通道阻滯劑能夠部分抑制TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化形成。TRPM7通道作為心肌成纖維細胞上主要的功能性Ca2+離子通道，很可能與TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化過程相關(guān)聯(lián)。
　　 神經(jīng)鞘脂類(Sphingolipids)分子是細胞膜的一個重要組成成分，同時在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)鞘脂類分子主要包括神經(jīng)酰胺(Cer

7、amide，Cer)、神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine，SPH)、1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine1-phophate，S1P)等。它們參與細胞的多種生物學(xué)過程，被稱作“具有生物活性的脂類”。最新的研究發(fā)現(xiàn)，某些神經(jīng)鞘脂類分子對TRP通道家族中的一些成員具有調(diào)節(jié)作用。因此我們推測神經(jīng)鞘脂類分子可能對TRPM7通道也有調(diào)節(jié)作用。
　　 為明確心肌纖維化的發(fā)生機制，本研究通過主動脈弓縮窄術(shù)(Transverse Aort

8、icConstriction，TAC)模擬和建立壓力超負荷(高血壓)致小鼠心肌纖維化模型，采用心臟超聲、免疫組織化學(xué)方法、電生理學(xué)方法、鈣比率熒光成像技術(shù)以及基因敲除等多種分子生物學(xué)技術(shù)，探討TRPM7在心肌纖維化形成中的作用和潛在的分子機制以及內(nèi)源性的神經(jīng)鞘磷脂分子及其結(jié)構(gòu)類似物對TRPM7通道活性的影響，以期為臨床上心肌纖維化的治療尋求新的干預(yù)靶點和新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　 實驗材料和方法
　　 將20只雄性C5

9、7BL/6小鼠(8-10周齡)隨機分為TAC模型組和假手術(shù)組，每組10只，運用心臟超聲監(jiān)測各實驗條件下小鼠心功能變化情況。于術(shù)后8周處死小鼠切取心臟，檢測心臟及肺臟的重量，計算心臟肥厚指數(shù)和肺重量指數(shù)。通過HE染色方法觀察心臟結(jié)構(gòu)變化；采用苦味酸.天狼猩紅膠原染色(Picro-siriusred)檢測心肌纖維化程度并計算心肌膠原容積分數(shù)(Cardiac collegen volumefraction，CVF)；通過Western blo

10、t檢測心肌組織中TRPM7蛋白表達水平。
　　 另將20只TRPM7基因敲除(TRPM7-/-)小鼠和20只野生型(WT)小鼠分別隨機分為TAC模型組和假手術(shù)組，即TRPM7-/-TAC組、TRPM7-/-Sham組、WT-TAC組和WT-Sham組，每組10只。分離和培養(yǎng)小鼠心室肌成纖維細胞，采用鈣比率熒光顯像技術(shù)測量WT模型組和WT假手術(shù)組小鼠心肌成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度；膜片鉗(全細胞)檢測心肌成纖維細胞TRPM7通道電流

11、變化。在通過PCR方法和Western Blot方法確認TRPM7基因敲除的基礎(chǔ)上，運用前述的相關(guān)實驗方法檢測各組小鼠心肌肥厚和心功能變化情況、心肌纖維化程度、TRPM7蛋白及TGFβ1蛋白表達水平。
　　 以穩(wěn)定高表達TRPM7通道的293-TRPM7細胞和人類及小鼠心肌成纖維細胞為研究對象，通過膜片鉗技術(shù)檢測內(nèi)源性的神經(jīng)鞘脂類分子及其結(jié)構(gòu)類似物一神經(jīng)鞘氨醇(SPH)、1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(S1P)、神經(jīng)酰胺(Ceramide)

12、、二甲基鞘氨醇(DMS)和芬戈莫德(FTY720)等對TRPM7通道活性的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、術(shù)后8周，超聲心動圖結(jié)果顯示：TAC組小鼠左心室壁厚度、左室內(nèi)徑均顯著高于Sham組(P<0.01)；左室射血分數(shù)和縮短分數(shù)均明顯低于Sham組(P<0.01)。HE染色顯示：TAC組小鼠心肌細胞體積明顯增大，心肌細胞間距明顯增寬，心肌肥厚指數(shù)顯著增加(P<0.01)。苦味酸.天狼猩紅心肌膠原染色顯示：TAC組小鼠心肌

13、膠原容積分數(shù)明顯升高(P<0.01)。Western Blot方法檢測結(jié)果顯示：TRPM7通道蛋白在TAC組小鼠纖維化心肌中表達上調(diào)(P<0.05)。
　　 2、術(shù)后8周，與WT-Sham組相比，WT-TAC組小鼠心肌成纖維細胞的Ca2+內(nèi)流顯著增加(P<0.05)、同時檢測到TRPM7通道電流幅度明顯增大(P<0.05)。與WT-TAC組相比，TRPM7-/-TAC組小鼠心肌肥厚程度減輕，心臟泵功能也明顯強于WT-TAC組(P

14、<0.01)。TRPM7-/-TAC組小鼠心肌組織中膠原形成減少，并且其心肌成纖維細胞TGFβ1蛋白表達量也減少。
　　 3、細胞外液分別灌流1μM的SPH、DMS和FTY720能夠完全阻斷HEK-293細胞的TRPM7通道電流，其IC50分別為0.59μM、0.3μM和0.72μM；而鞘磷脂分子Ceramides、SIP和SPH結(jié)構(gòu)類似物FTY720-P對TRPM7通道的活性無明顯作用。同樣，SPH、DMS和FTY720對TR

15、PM7通道電流的抑制作用在人類心房肌成纖維細胞和小鼠心肌成纖維細胞上也得到證明。
　　 結(jié)論
　　 1、在采用主動脈弓縮窄術(shù)(TAC)制作的壓力超負荷小鼠模型中，檢測出心臟泵功能減弱，出現(xiàn)了心室肌肥厚、心肌纖維化。
　　 2、TRPM7通道蛋白在小鼠纖維化心肌中表達水平升高。TRPM7通道可能通過增強介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，促進心肌纖維化的形成。其中，調(diào)節(jié)心肌成纖維細胞TGF-β1表達是其作用機制之一。