高遷移率族蛋白B-1在壓力超負(fù)荷心肌肥厚中的作用及信號通路研究.pdf

1、心肌重構(gòu)是多種心臟疾病的發(fā)生基礎(chǔ),如缺血性心肌病及高血壓心臟病等都伴隨明顯的心臟結(jié)構(gòu)改變。炎癥細(xì)胞及炎癥相關(guān)因子的作用在心血管疾病發(fā)病機制的研究上已受到越來越多的關(guān)注和重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),炎癥因子參與心肌重構(gòu)的病理過程,但其在不同病因誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中所發(fā)揮的作用不盡相同。
　　機械壓力的刺激及神經(jīng)體液因素的影響在高血壓心肌肥厚形成過程中至關(guān)重要。此外,研究發(fā)現(xiàn)高血壓時不僅心肌內(nèi)肥大細(xì)胞增多1、外周血單核細(xì)胞也得到激活2,3。因此,人們

2、逐漸認(rèn)識到,白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等多種炎癥因子都與高血壓密切相關(guān)4-6,并可能參與形成高血壓心肌肥厚7-10。如壓力超負(fù)荷能促進(jìn)心肌細(xì)胞表達(dá)TNF-α,而阻斷TNF-α不僅可以減輕壓力超負(fù)荷條件下的炎癥反應(yīng),還能抑制心肌肥厚形成11,12。
　　高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)是一種重要的致炎因子,廣泛分布于各種組織細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞受到損傷或刺激時,其主動或被

3、動分泌到細(xì)胞外后刺激單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子,而這些炎癥因子又可以正反饋促進(jìn)HMGB1分泌13-15,并增加內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子表達(dá),發(fā)揮炎癥放大作用,這對延長和維持炎性反應(yīng)至關(guān)重要16。因此,我們推測HMGB1可能也參與高血壓心肌損傷,并促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展。
　　本研究首先針對慢性心力衰竭患者心臟功能及結(jié)構(gòu)與炎癥因子之間的關(guān)系進(jìn)行討論,旨在通過結(jié)合體內(nèi)、外實驗,觀察以HMGB1為代表的

4、炎癥因子在壓力超負(fù)荷心肌肥厚中的作用并探討其受體信號通路,從而進(jìn)一步闡明高血壓心肌肥厚的發(fā)病機制,為該疾病的防治提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分
　　慢性心力衰竭患者心臟功能及結(jié)構(gòu)與炎癥因子之間的關(guān)系研究
　　目的：采用Meta分析方法系統(tǒng)評價具有抗炎作用的他汀類藥物對慢性心力衰竭患者血清炎癥因子與心臟功能及結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法：系統(tǒng)檢索PubMed、Medline、EMBASE、EBMReviewsdatab

5、ases等數(shù)據(jù)庫。由兩名研究者獨立篩選以觀察他汀類藥物對慢性心力衰竭患者心臟功能、結(jié)構(gòu)及血清炎癥因子影響為目的的隨機化對照研究,并提取相關(guān)數(shù)據(jù)加以分析。采用隨機化效應(yīng)模型進(jìn)行薈萃分析,并用權(quán)重均差(WMD)/標(biāo)準(zhǔn)化均差(SMD)及95％可信區(qū)間(95％CI)加以量化。
　　結(jié)果：共檢出相關(guān)文獻(xiàn)4209篇,篩選出符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)共14篇,涉及慢性心衰總病例數(shù)6265例。薈萃分析顯示,與對照組相比,他汀類藥物可明顯提高心衰患者左室射

6、血分?jǐn)?shù)(LVEF,WMD=3.35％,95％CI=0.80～5.91％,P=0.01),顯著減小左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD,WMD=-3.77mm,95％CI=-6.24～-1.31mm,P=0.003),以及左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD,WMD=-3.57mm,95％CI=-6.37～-0.76mm,P=0.01)。另外,他汀類藥物還能明顯降低心衰患者血清B型腦鈉肽水平(BNP,WMD=-83.17pg/ml,95％CI=-121.

7、29～-45.05pg/ml,P＜0.0001)和NYHA分級(WMD=-0.30,95％CI=-0.37～-0.23,P＜0.00001)。在對血清炎癥相關(guān)因子的作用方面,他汀類藥物不僅對降低心衰患者高敏C反應(yīng)蛋白水平上有效(hsCRP,SMD=-0.74,95％CI=-1.16～-0.32,P=0.0005),還能降低可溶性血管細(xì)胞粘附因子1(sVCAM-1,SMD=-0.49,95％CI=-0.91～-0.08,P=0.02)。M

8、eta回歸及亞組分析表明,患者年齡、病因、基礎(chǔ)LVEF、他汀藥物種類,以及隨訪時間等因素都可能影響他汀類藥物對慢性心衰患者的作用,且較短期治療而言(＜1年),他汀類藥物長期治療(≥1年)可能更有利于降低心衰患者h(yuǎn)sCRP及白細(xì)胞介素6(IL-6)水平,同時他汀類藥物提高LVEF的作用也呈明顯時間依賴性(P=0.03)。
　　結(jié)論：他汀類藥物不僅能降低慢性心力衰竭患者血清炎癥因子表達(dá)水平,還可能改善心室重構(gòu)、增強心臟功能,并緩解臨床

9、癥狀,且心衰患者血清炎癥因子降低更明顯的同時,可能心功能增強也越顯著,提示慢性心衰患者心臟功能及結(jié)構(gòu)可能與血清炎癥因子表達(dá)水平密切相關(guān)。
　　第二部分
　　壓力超負(fù)荷小鼠模型構(gòu)建及其心臟組織中高遷移率族蛋白B-1的變化
　　目的：利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負(fù)荷小鼠模型,并觀察壓力超負(fù)荷對小鼠心臟組織中炎癥因子高遷移率族蛋白B-1(HNGB1)表達(dá)的影響。
　　方法：利用主動脈弓縮窄(TAC)方法在8-10周齡

10、野生型雄性健康成年C57BL/6小鼠體內(nèi)構(gòu)建壓力超負(fù)荷模型(縮窄比例約為70％),并按TAC不同時間隨機分為6組:TAC-0天(對照):TAC-1天;TAC-3天:TAC-7天;TAC-14天;TAC-28天。行小鼠經(jīng)胸心臟超聲檢測,觀察心臟功能及形態(tài)變化,并同時測定小鼠主動脈及左心室壓力。上述檢測后,觀察離體心臟大小并計算心重/體重比(mg/g)。垂直心臟長軸制作小鼠心臟石蠟切片,經(jīng)蘇木精一伊紅(HE)染色和馬森(Masson)染色觀

11、察心臟形態(tài)、心肌細(xì)胞大小,以及纖維化程度改變。應(yīng)用蛋白免疫印跡法(westernBlot)及免疫組織化學(xué)染色法(IHC)檢測心臟HMGB1表達(dá)水平及表達(dá)部位。另外,本研究還借助細(xì)胞培養(yǎng)牽張裝置在體外模擬壓力超負(fù)荷,檢測牽張刺激對心肌細(xì)胞內(nèi)HMGB1表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：TAC術(shù)后1天至28天,小鼠主動脈收縮壓及左心室收縮末壓均較對照組顯著升高(P＜0.01),且升高幅度未見明顯變化。心超結(jié)果顯示,TAC術(shù)后1天、3天及28天

12、時,左室射血分?jǐn)?shù)及左室縮短分?jǐn)?shù)較對照明顯降低(P＜0.01);左心室容積與內(nèi)徑也發(fā)生類似改變(P＜0.05);TAC術(shù)后14天時,收縮末期及舒張末期左心室前壁與后壁均明顯增厚(P＜0.01)。觀察離體心臟發(fā)現(xiàn),心臟在TAC術(shù)后14天及28天時明顯擴大,心重/體重比檢測也進(jìn)一步證實該變化(P＜0.05)。HE染色同樣發(fā)現(xiàn),TAC術(shù)后1天和3天時左心室腔較對照稍擴大,28天時明顯擴大,而在14天時則呈現(xiàn)向心性肥厚,且心肌細(xì)胞橫截面面積(CS

13、A)顯著增大(P＜0.01)。Masson染色結(jié)果表明,心臟在TAC術(shù)后14天開始出現(xiàn)輕微纖維化改變,并于28時顯著加重。WesternBlot與IHC結(jié)果顯示,Tac術(shù)后3天及7天時,心臟組織高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),且由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿和細(xì)胞外。另外,機械牽張心肌細(xì)胞12小時后可見細(xì)胞內(nèi)HMGB1水平明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：本研究成功利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負(fù)荷小

14、鼠模型。小鼠左心功能在TAC術(shù)后3天內(nèi)受抑,之后逐漸恢復(fù)正常,至2周時出現(xiàn)代償性心肌肥厚,并于4周時進(jìn)入失代償狀態(tài)。壓力超負(fù)荷可引起心臟組織中HMGB1表達(dá)增加及活化,且增加的HMGB1可能來源于心肌細(xì)胞。
　　第三部分
　　高遷移率族蛋白B-1對壓力超負(fù)荷小鼠心肌肥厚的影響及可能機制
　　目的：觀察高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對壓力超負(fù)荷小鼠心臟功能及結(jié)構(gòu)的影響,并初步探討其作用機制。
　　方法：利用主動

15、脈弓縮窄(TAC)方法在8-10周齡野生型雄性健康成年C57BL/6小鼠體內(nèi)構(gòu)建壓力超負(fù)荷模型(縮窄比例約為70％)并/或采用心肌內(nèi)注射法在小鼠心臟中注射PBS或HMGB1重組蛋白。按不同干預(yù)措施將小鼠分為4組:假手術(shù)組:HMGB1組;TAC+PBS組;TAC+HMGB1組。分別于2周及4周時行小鼠經(jīng)胸心臟超聲檢測,觀察心臟功能及形態(tài)變化,并同時測定小鼠主動脈及左心室壓力。上述檢測后,觀察離體心臟大小并計算心重/體重比(mg/g)。垂直

16、心臟長軸制作小鼠心臟石蠟切片,經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色和馬森(Masson)染色觀察心臟形態(tài)、心肌細(xì)胞大小,以及纖維化程度改變。應(yīng)用蛋白免疫印跡法(WesternBlot)檢測心臟組織磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)和磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比較,單純心肌內(nèi)注射HMGB1未對血壓造成影響,而TAC術(shù)后小鼠主動脈收縮壓及左心室收縮末壓在2周和4周時均明顯升高(P

17、＜0.01)。心超檢測發(fā)現(xiàn),2周時,TAC+HMGB1組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)較其余各組顯著增高(P＜0.05),左室收縮末期及舒張末期容積則較假手術(shù)組明顯減小(P＜0.05);與假手術(shù)組小鼠比較,TAC+PBS組及TAC+HMGB1組小鼠左室收縮末期和舒張末期前壁及后壁厚度明顯增加(P＜0.01),且TAC+HMGB1組小鼠較TAC+PBS組小鼠更厚(P＜0.01)。4周時,HMGB1組、TAC+PBS

18、組及TAC+HMGB1組LVEF及LVFS均明顯較假手術(shù)組降低(P＜0.05),且TAC+HMGB1組較TAC+PBS組低(P＜0.05);INGB1組、TAC+PBS組及TAC+HMGB1組左室收縮末期容積均較假手術(shù)組小鼠明顯增加(P＜0.05),且TAC+HMGB1組左室舒張末期內(nèi)徑較假手術(shù)組小鼠明顯增加(P＜0.05);HMGB1組小鼠左室收縮末期前壁及后壁厚度均較假手術(shù)組小鼠明顯變薄(P＜0.05),而TAC+PBS組及TAC+

19、HMGB1組室壁厚度較2周時變薄(P＜0.01)。2周及4周時,TAC+PBS組及TAC+HMGB1組小鼠離體心臟明顯增大,且心重/體重比明顯大于假手術(shù)組(P＜0.05)。HE染色與心超檢測結(jié)果一致,2周時TAC+PBS組小鼠心肌細(xì)胞CSA較假手術(shù)組明顯增大(P＜0.01),且TAC+HMGB1組最大(P＜0.01)。Masson染色結(jié)果提示,HMGB1可以直接導(dǎo)致并加重壓力超負(fù)荷心肌纖維化。WesternBlot結(jié)果顯示,2周時TAC

20、+HMGB1組小鼠心臟組織中p-ERK1/2及p-STAT3表達(dá)水平較TAC+PBS組增高,且兩組均高于假手術(shù)組。
　　結(jié)論：壓力超負(fù)荷促使小鼠發(fā)生代償性心肌肥厚,并最終導(dǎo)致心功能不全。HMGB1可加重壓力超負(fù)荷所致小鼠心肌肥厚、心肌纖維化以及心功能不全,且該作用可能與ERK1/2信號通路及STAT3信號通路有關(guān)。
　　第四部分
　　高遷移率族蛋白B-1對心肌細(xì)胞作用的受體信號通路研究
　　目的：觀察高遷移率族蛋

21、白B-1對心肌細(xì)胞內(nèi)肥厚相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,并探討其受體信號通路。
　　方法：利用1-2日齡SD大鼠分離、培養(yǎng)心肌細(xì)胞,借助細(xì)胞培養(yǎng)牽張裝置在體外對心肌細(xì)胞進(jìn)行機械牽張刺激,以模擬壓力超負(fù)荷。對心肌細(xì)胞進(jìn)行機械牽張和/或HMGB1(100ng/ml)刺激0分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時,以及24小時后檢測細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)、P38激酶(p-P38)、Janus激酶2(

22、p-JAK2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3),以及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和Toll樣受體4(TLR-4)表達(dá)變化。此外,在阻斷RAGE或TLR-4條件下,對心肌細(xì)胞給予HMGB1(100ng/ml)刺激30分鐘后檢測上述激酶的變化。
　　結(jié)果：機械牽張刺激或HMGB1刺激在1小時內(nèi)均能顯著上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)、磷酸化P38激酶(p-P38)、磷酸化Janus激酶2(p

23、-JAK2)及磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)蛋白表達(dá)水平(P均＜0.05),且在激活心肌細(xì)胞內(nèi)ERK1/2上,機械牽張和HMGBl刺激具有明顯的協(xié)同作用(P＜0.05)。其次,機械牽張刺激在24小時內(nèi)可明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞RAGE和TLR-4受體蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)。另外,通過阻斷心肌細(xì)胞表面RAGE或TLR-4受體后發(fā)現(xiàn),部分阻斷RAGE受體可有效抑制HMGB1上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的作用(P＜0.05)