腫瘤細(xì)胞CRT表達(dá)對(duì)荷瘤小鼠免疫環(huán)境的影響及其應(yīng)用于過繼免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討鹽酸米托葸醌(mitoxantrone hydrochloride,MIT)對(duì)B16細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白(CRT)表達(dá)的影響,觀察高表達(dá)CRT的黑素瘤B16細(xì)胞膜抗原疫苗對(duì)小鼠抗腫瘤免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的影響;同時(shí)觀察高表達(dá)CRT的B16細(xì)胞膜抗原沖擊后DCs誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對(duì)荷黑素瘤小鼠的治療效果。
　　 方法:用MIT處理B16細(xì)胞,免疫熒光法檢測B16細(xì)胞膜表面CRT的表達(dá),檢測得知MIT可以上調(diào)B16細(xì)胞CRT的表達(dá)。分別用

2、不同劑量的MIT治療荷瘤小鼠,用普通B16細(xì)胞膜抗原和MIT處理過的B16細(xì)胞膜蛋白作為疫苗對(duì)荷瘤小鼠模型進(jìn)行預(yù)防接種。體外用普通B16細(xì)胞膜抗原和MIT處理過的B16細(xì)胞膜抗原分別沖擊DCs之后誘導(dǎo)特異性CTLs治療荷瘤小鼠。流式細(xì)胞學(xué)觀察小鼠腫瘤組織中CRT表達(dá),脾臟不同T細(xì)胞比例變化,免疫組化檢測小鼠腫瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞、DCs的浸潤情況,描計(jì)小鼠腫瘤體積曲線,觀察對(duì)荷黑素瘤小鼠的治療效果。
　　 結(jié)果:
　　 1.分

3、別用0.0μg/ml、0.25μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml濃度MIT處理B16細(xì)胞,4組腫瘤細(xì)胞CRT的表達(dá)陽性率分別為:(29.40±3.57)％;(42.80±4.59)％;(56.20±5.55)％;(72.20±2.94)％,CRT表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05),且CRT表達(dá)呈劑量依賴性(P＜0.05)。Western blotting鑒定顯示,4.0μg/ml濃度MIT組B16細(xì)胞膜CRT相對(duì)表達(dá)為472±23,

4、0.0μg/ml MIT組B16細(xì)胞膜CRT相對(duì)表達(dá)為117±18(P＜0.01)。
　　 2.用2.0、4.0、8.0mg/kg MIT注射治療荷瘤小鼠,與對(duì)照組相比3種劑量MIT可以不同程度可以提高小鼠模型腫瘤組織CRT表達(dá),流式細(xì)胞學(xué)檢測其CRT表達(dá)量分別為:5.134±0.95;7.40±0.86;9.17±1.06,與對(duì)照組3.21±1.37相比有顯著差別(P＜0.05)。
　　 3.免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示:2.0、

5、4.0、8.0mg/kg MIT組和MIT-B16蛋白疫苗組小鼠模型腫瘤組織內(nèi)部的DCs數(shù)量均顯著高于荷瘤對(duì)照組小鼠(P＜0.05);2.0、4.0mg/kg MIT組和MIT-B16蛋白疫苗組小鼠模型腫瘤組織內(nèi)部的T細(xì)胞數(shù)量均顯著高于荷瘤對(duì)照組小鼠(P＜0.01)
　　 4.流式細(xì)胞學(xué)檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞顯示:4.0mg/kg MIT組、MIT-B16蛋白疫苗組、B16-DCs-CTLs組、MIT-B16-DCs-CTLs組

6、小鼠脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞比例與荷瘤小鼠相比有顯著提高(P＜0.01);2.0、4.0、8.0mg/kg MIT組、MIT-B16蛋白疫苗組、B16-DCs-CTLs組、MIT-B16-DCs-CTLs組小鼠脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞比例與荷瘤小鼠相比有顯著提高(P＜0.05)
　　 5.第14日處死小鼠測量腫瘤體積(cm3),各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積均明顯小于與荷瘤對(duì)照組小鼠6.944±0.81(P＜0.01),其中2.0、4.0、8

7、.0mg/kg MIT組小鼠腫瘤體積分別為4.074±0.77、2.35±0.54、1.21±0.39,3組有明顯差別(P＜0.05);B16蛋白疫苗組,MIT-B16蛋白疫苗組腫瘤體積分別為4.15±0.57、1.674±0.33,2組有明顯差別(P＜0.05);B16-DCs-CTLs組、MIT-B16-DCs-CTLs組腫瘤體積分別為:1.09±0.25、0.594±0.21,2組有明顯差別(P＜0.05);其中各治療組中MIT-

8、B16-DCs-CTLs組腫瘤體積均小于其他各組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MIT能夠上調(diào)CRT在B16腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá),相似的MIT可以提高小鼠黑色素瘤組織中CRT的表達(dá),且在小鼠承受的范圍內(nèi)CRT表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性;適當(dāng)劑量的MIT能夠提高小鼠黑色素瘤組織中浸潤的DCs和T細(xì)胞的數(shù)量,提高小鼠脾臟中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例,形成特異性的抗腫瘤免疫。
　　 2.高表達(dá)CRT的B16細(xì)胞