FoxO1過表達對糖尿病大鼠腎臟系膜細胞增殖及細胞外基質堆積的影響及機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥，系膜細胞過度增殖在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1，2]。叉頭狀轉錄因子O1（Forkhead transcription factor O1，FoxO1）是FoxO亞家族中的一員，主要通過PI3K/AKT信號通路聚集細胞內外的多重下游信號分子，調節(jié)細胞內外應激信號之間的平衡，在抗氧化應激，調節(jié)糖脂代謝及細胞周期調控等方面有

2、著重要的作用[3,4]。目前關于FoxO1調控細胞周期，抑制細胞增殖的研究主要集中于抗腫瘤方面，而其與糖尿病腎病中系膜細胞增殖的關系，研究較少。本課題組既往研究發(fā)現，在糖尿病大鼠腎皮質內，FoxO1 mRNA水平降低，其蛋白磷酸化水平增高，病理顯示系膜細胞過度增生，細胞外基質堆積，表明FoxO1與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展有著重要關系。
　　p27Kip1是一種細胞周期依賴性激酶抑制劑，可以抑制多種細胞的增殖，其在調節(jié)細胞增殖，分化，凋亡

3、方面有著舉足輕重的作用。研究表明，p27Kip1作為FoxO1重要的下游靶基因，其表達的降低與多種腫瘤的發(fā)生密切相關[5，6]。因此，在糖尿病大鼠體內，FoxO1是否是通過調節(jié)p27Kip1的表達來抑制系膜細胞的增殖，從而減輕糖尿病腎臟病變，目前尚不清楚。本研究在動物體內，通過大鼠腎臟靶向性注射慢病毒，上調FoxO1的表達及活性，從而觀察其對腎臟系膜細胞增殖及細胞基質堆積的影響并探討其可能機制。
　　材料與方法：
　　構建空

4、慢病毒載體(LV-NC-GFP)及大鼠組成性激活突變型FoxO1慢病毒載體(LV-CA-FoxO1)。8周齡健康SPF級雄性SD大鼠，體重（220±20）g，適應性喂養(yǎng)1周，室溫25℃，晝夜交替12小時，隨機選取100只構建糖尿病大鼠模型，30只作為正常對照組。造模方法如下:禁食12小時后，按60mg/kg一次性腹腔注射1％STZ溶液，正常組注射相當體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，72小時后連續(xù)3次測量血糖(Blood Glucose，B

5、G)，BG≥16.7mmol/L為成模標準(4只失敗)，將成模糖尿病大鼠隨機分為2周，4周，8周3個時期，各時期分為3組:糖尿病組（DM組），糖尿病FoxO1過表達轉染組（CA組）和糖尿病空病毒轉染組(NC組)。以糖尿病大鼠右側背部為手術入口，暴露大鼠右側腎臟，腎臟皮質多部位注射組成性激活突變型FoxO1慢病毒載體或空病毒載體100μl，DM組注射同等體積的生理鹽水，然后逐層縫合。于病毒注射后2周、4周、8周末，代謝籠收集24小時尿，用

6、于測定24小時尿蛋白(UPro/24h)及尿白蛋白定量(UAIb)。稱量體重（Body Weight，BW）后用水合氯醛麻醉大鼠，眼眶取血，分離血清檢測血肌酐(serum creatinine，Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)。剝離右腎，稱重并計算腎重指數(kidney weight/body weight ratio，KI)后取注射部位腎皮質加OCT混合物（opti-mumcutting temper

7、ature compound）迅速于液氮中冷凍，制備冰凍切片，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)表達，以確定慢病毒是否轉染成功。取注射部位約1mm3大小腎皮質置于4％預冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查，取部分腎皮質于4％多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫組化檢查。剩余腎皮質迅速置于液氮中保存，熒光定量PCR檢測腎皮質中FoxO1、p27Kip1、纖溶酶原激活物抑制物(Plasmin

8、ogen activator inhibitor-1，PAI-1)、纖連蛋白(Fibronectin，FN)、腎小球膠原Ⅳ(Collagen Ⅳ，Col Ⅳ)mRNA表達水平。Western bloting檢測腎皮質中FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、p27Kip1、PAI-1蛋白表達。免疫組化檢測FN、ColⅣ表達情況。
　　結果：
　　1.2周，4周，8周糖尿病大鼠腎皮質冰凍切片于倒置熒光顯微鏡下均可以觀察

9、到大量GFP表達，說明慢病毒載體成功轉染大鼠腎皮質并穩(wěn)定表達外源基因。
　　2.與NG組比較，DM組及NC組大鼠精神萎靡、飲水量及尿量多、墊料潮濕。CA組精神接近于正常組大鼠，而飲水量和尿量仍然較高，墊料較潮。與NG組相比，DM組各時間段體重（Bodyweight，BW）明顯降低，BG、腎重指數(kidneyweight/bodyweightratio，KI)升高(P＜0.05），其中2周時UPro/24h、UA1b、Ser、BU

10、N無顯著性差異(P＞0.05）。4周，8周時，上述指標逐漸升高(P＜0.05)。CA組與DM組相比，2周時各指標無顯著性差異(P＞0.05)，而4周，8周時KI、UPro/24h、UA1b、Ser、BUN均明顯降低(P＜0.05)，BW、BG比較無顯著學差異(P＞0.05)。NC組與DM組比較各指標之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.HE染色顯示NG組大鼠腎小球結構清晰;DM組與NC組大鼠腎小球系膜細胞明顯增生，系膜基

11、質增多，CA組上述病理改變明顯減輕。電鏡超微結構顯示NG組腎小球基底膜厚度均一，足突分布均勻，無微絨毛化，系膜細胞及基質無增生;DM組與NC組大鼠隨時間進展基底膜增厚或者不光滑，足突融合逐漸加重，系膜細胞及基質結節(jié)性增生;CA組大鼠足突融合改善，系膜細胞及基質輕度增生。
　　4.與NG組相比，DM組各時間段FoxO1、p27Kip1的mRNA表達明顯降低（P＜0.05），PAI-1、FN、ColⅣmRNA表達升高(P＜0.05)。

12、CA組較DM組FoxO1、p27Kip1mRNA水平明顯升高(P＜0.05）。PAI-1、FN、ColⅣmRNA表達則顯著降低(P＜0.05)。
　　5.各時間段，與NG組相比，DM組FoxO1表達無顯著性差異（P＞0.05），而p-FoxO1及p-FoxO1/FoxO1比值明顯增加(P＜0.05)，CA組較DM組FoxO1表達明顯升高，p-FoxO1表達無差異(P＞0.05），p-FoxO1/FoxO1比值則顯著降低(P＜0.0

13、5)，上述結果表明腎臟轉染FoxO1慢病毒后其表達及活性顯著升高。與NG組相比，DM組p27Kip1蛋白表達明顯降低（P＜0.05），PAI-1表達升高(P＜0.05)，CA組較DM組p27Kip1蛋白表達明顯升高(P＜0.05），PAI-1表達明顯降低(P＜0.05)，NC組與DM組之間各指標無顯著性差異(P＞0.05）。
　　6.免疫組化顯示，隨時間進展，DM組FN及ColⅣ表達逐漸升高（P＜0.05）。CA組上述指標表達明顯