蕨麻正丁醇部位對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的蛋白組學研究.pdf

1、目的：研究蕨麻正丁醇部位對大鼠結扎冠狀動脈所致急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其蛋白表達差異的影響，進而探討蕨麻正丁醇部位心肌保護作用的藥理機制。
　　 方法：選取雄性SD大鼠隨機分為手術對照組，模型組，蕨麻正丁醇部位49.3mg.kg-1，98.6mg·kg-1，197.2m g·kg-1干預組，復方丹參328.6mg·kg-1干預組。手術對照組給予3‰羧甲基纖維素（CMC），連續(xù)灌胃14天，通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支建立

2、急性心肌缺血再灌注模型。測定各處理組動物心電圖的變化；取心肌組織進行常規(guī)HE染色；取血清檢測LDH、CK、SOD活性及MDA含量；透射電鏡檢測急性心肌缺血再灌注損傷以后心肌細胞超微結構的變化；提取各組心肌組織蛋白，經雙向電泳和銀染得到雙向電泳圖譜，用PDOuest7.0軟件進行圖像分析；考馬斯亮藍染色后，取蛋白點進行酶解，再用MALDI-TOF-MS進行分析，使用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行搜索，鑒定差異蛋白質的種類并采用

3、western blot方法進一步驗證。
　　 結果：
　　 1.蕨麻正丁醇部位對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用：（1）各組心電圖ST段變化：模型組心電圖ST段發(fā)生明顯偏移。與模型組相比，中高劑量蕨麻正丁醇部位給藥組和復方丹參藥物組心電圖ST段變化幅度明顯降低。（2）HE染色：模型組組織病理學改變顯著，心肌間質出現(xiàn)炎細胞浸潤，心肌纖維嗜酸性變，肌節(jié)斷裂，壞死；蕨麻高、中劑量組心肌損傷程度較模型組減輕，低劑量組與模型

4、組比較未見明顯改善。（3）心肌超微結構的變化：電鏡結果顯示蕨麻正丁醇高劑量組能夠減輕心肌細胞缺血再灌注損傷導致的線粒體腫脹、空泡化，核周間隙擴增等超微結構的損傷改變，維持相對整齊的心肌纖維排列。（4）血清LDH、CK檢測：與模型組相比，給予中高劑量蕨麻正丁醇部位均可顯著降低缺血再灌注大鼠血清LDH活性（P<0.01）和CK活性（P<0.01）；（5）血清MDA、SOD檢測：與模型組相比，各濃度蕨麻正丁醇部位均可顯著提高缺血再灌注大鼠血清

5、中SOD活力（P<0.01），減少MDA的產生（P<0.01、），且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　 2.大鼠心肌組織蛋白雙向電泳圖譜分析
　　 經PDquest軟件分析檢測到的各組總蛋白點數(shù)：對照組1003±23，丹參組918±65，低劑量組877±72，中劑量組1046±43，高劑量組891±23，模型組738±69。分離的蛋白點多分布于P14.8-9.0、MW30kDa-70kDa的范圍。模型組與手術對照組比較（P<0

6、.05），其中分析后表達升高的有5個點，降低的有39個點，45個點未見表達。在表達升高的5個點中有1個點被蕨麻正丁醇部位高，中劑量組及復方丹參組下調。在模型組未見表達的45個點中，能被三個劑量組共同上調的有6個點，復方丹參組有3個點與蕨麻正丁醇部位相同。在表達降低的39個點中，能被三個劑量組及復方丹參組共同上調的有4個點。
　　 3.差異蛋白質的質譜鑒定
　　 對取得的7個差異蛋白質點進行MALDI-TOF質譜鑒定，得分

7、均大于61分（P<0.05），可以確認蛋白質種類。分別為αB晶體蛋白（alpha B-crystallin）、磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP）、輔酶Q10（NADH dehydrogenase1 alpha10）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）、肌球蛋白輕鏈3（myosin，light chain3）、肌球蛋白輕鏈2（Myosin

8、 regulatory light chain2），αB晶體蛋白CRA b亞基（crystallin.alpha B，isoform CRA b）
　　 4.Western blot驗證
　　 Western blot實驗顯示，輔酶Q10在心肌細胞中存在表達，且該蛋白在心肌缺血再灌注損傷后以及藥物干預后表達的變化趨勢與雙向電泳圖像經PDQuest軟件分析后得到的蛋白質變化趨勢相一致。
　　 結論：
　　

9、1.蕨麻正丁醇部位能夠改善急性心肌缺血再灌注所致的心肌組織形態(tài)的病理改變，保護心肌組織的超微結構，其作用與其清除自由基的能力有關。
　　 2.心肌缺血再灌注損傷可引起心肌蛋白質表達變化，其中部分差異蛋白可被藥物干預向對照組的方向調節(jié)，提示組織中出現(xiàn)的差異蛋白質中部分可能為心肌損傷誘導的基因表達產物及藥物作用靶點。
　　 3.經過驗證，蕨麻正丁醇部位能通過上調輔酶Q10蛋白，減少自由基的產生，減輕膜脂質過氧化保護損傷，從而