TLR9在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤,盡管包括手術(shù)切除,放射治療和化學(xué)治療在內(nèi)的綜合治療策略的聯(lián)合應(yīng)用,高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍不盡人意,特別是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)惡性程度最高的惡性腫瘤,占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的15-20％。多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有細(xì)胞異質(zhì)性、分裂極度活躍、腫瘤微血管增生和壞死的組織病理特點(diǎn)。多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的平均中位生存期只有大約一年,在過去的十年中沒有顯著改善。因此,迫切需要開發(fā)新的治療策略或新的輔助治療方法

2、。
　　 未甲基化的CpG二核苷酸在細(xì)菌和病毒DNA中相當(dāng)常見,但是在脊椎動物中卻減弱并被甲基化。包含非甲基化的CpG雙核苷酸序列在內(nèi)的特定核苷酸序列具有強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)功能,可以作為癌癥疫苗的免疫佐劑。CpG-ODN是人工合成的含有未甲基化CpG基序的單鏈寡聚脫氧核苷酸,可以模仿細(xì)菌或病毒DNA對脊椎動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用。根據(jù)作用特點(diǎn)的差別,CpG-ODN可被分成三類,其中B類CpG-ODN能刺激B細(xì)胞增生和活化,目前己作

3、為癌癥疫苗的免疫佐劑在臨床試驗中使用。B型CpG-ODN對哺乳動物免疫細(xì)胞增生活化的刺激作用主要是通過與Toll樣受體9結(jié)合,進(jìn)而激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌和釋放,并誘發(fā)強(qiáng)有力的T細(xì)胞抗瘤免疫反應(yīng)。
　　 最近的一些研究表明,除漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞中有表達(dá)外,TLR9的也表達(dá)在某些腫瘤細(xì)胞,研究者證實乳腺、胃、肺和淋巴性的上皮性腫瘤中存在TLR9的表達(dá)。然而大量數(shù)據(jù)表示,TLR9的激動劑CpG寡核苷酸可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展

4、和轉(zhuǎn)移。膠質(zhì)瘤屬于神經(jīng)上皮性腫瘤,我們推測TLR9在膠質(zhì)瘤中可能存在表達(dá)。我們的預(yù)試驗驗證了我們的想法,在細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤標(biāo)本中都檢測出了其表達(dá)。我們假設(shè),TLR9的信號通路可能在腦膠質(zhì)瘤生長和進(jìn)展中非常重要。TLR9信號通路在人腦膠質(zhì)瘤的確切作用目前還不清楚,其對膠質(zhì)瘤生長是促進(jìn)還是抑制,目前還沒有相關(guān)報道。有實驗報道局部使用CpG寡核苷酸免疫治療可以延長膠質(zhì)瘤小鼠的生存期。相反,Ginzkeyetal等人發(fā)現(xiàn)在大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中瘤內(nèi)注

5、射免疫刺激劑CpG寡核苷酸,腫瘤大小反而增加,這與我們先前所做的實驗結(jié)果一致,在以前的實驗中我們發(fā)現(xiàn)的CpG寡核苷酸瘤內(nèi)注射并不能增加GL261膠質(zhì)瘤荷瘤鼠的生存時間,這結(jié)果提示,CpG直接局部注射,可能不會在膠質(zhì)瘤患者產(chǎn)生有益的結(jié)果。
　　 已有研究者初步檢測了TLR9在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá),但沒有發(fā)現(xiàn)其對預(yù)后的意義。我們認(rèn)為此研究存在一定的局限性,其研究僅進(jìn)行了TLR9 mRNA水平的評價,而沒有進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的研究,由于蛋

6、白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn),因此檢測TLR9蛋白在膠質(zhì)瘤中表達(dá)是十分必要的,這對于提高對CpG-ODN惡性膠質(zhì)瘤的免疫輔助治療的認(rèn)識是至關(guān)重要的。目前還沒有系統(tǒng)的TLR9蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況和作用機(jī)制的研究。本研究將應(yīng)用組織芯片技術(shù),探討TLR9蛋白在大樣本的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣品中的表達(dá)情況,分析TLR9的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系以及TLR9表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期之間的關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步闡述TLR9的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞可能發(fā)揮的作用,我們還將

7、探討CpG寡核苷酸在體外對的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的直接影響。
　　 研究TLR9在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和功能,及其信號傳導(dǎo)通路,對于理解神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成和惡性進(jìn)展有重要幫助,同時也提供了膠質(zhì)瘤新的有效治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)
　　 惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG,U251-MG和大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系從ATCC(美國組織培養(yǎng)細(xì)胞庫)購得,并在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)

8、。膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG、U251-MG和C6細(xì)胞以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),于37℃,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素和5％CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 二、RNA提取及RT-PCR檢測TLR9的表達(dá)
　　 采用Trizol試劑一步法提取人腦膠質(zhì)瘤U87-MG、人腦膠質(zhì)瘤U251-MG細(xì)胞系、大鼠腦膠質(zhì)瘤C6和手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤組織總RNA,紫外分光光度計檢測OD260/OD28

9、0及核酸濃度。提取細(xì)胞系和腫瘤標(biāo)本的總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成。按照RT-PCR試劑盒的說明,應(yīng)用特異性引物人類TLR9(F:5’-TGTAATAACAGTTGCCGTCCAT-3’,R:5’-CAGCCTTTCCTTGTCCTCC-3’),大鼠TLR9(F:5’-GGACAGTTCTCTCCACTCGC-3’,R:5’-TTCTTTGAGACGGGAGTGCT-3’)；人和大鼠管家基因GAPDH(F:5’-TCCACCACCCTG

10、TTGCTGTA-3’,R:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳,并在紫外線下的觀察。
　　 三、免疫熒光檢測TLR9蛋白在細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 U87-MG和U251細(xì)胞在蓋玻片上爬片生長,蓋玻片用無血清培養(yǎng)液沖洗后,4％多聚甲醛固定,0.5％Trixton X-100的PBS透膜,并在含5％胎牛血清的PBS中封閉1小時。細(xì)胞與TLR9的單克隆抗體在4℃孵

11、育過夜,然后由Cy3標(biāo)記的抗鼠的二抗孵育2小時,細(xì)胞核用Hoechest復(fù)染。在對照樣品中,去掉一抗,膠質(zhì)瘤細(xì)胞用二抗和Hocchcst染色。然后應(yīng)用熒光激發(fā)Cy3和Hoechest,共聚焦顯微鏡下觀察TLR9在細(xì)胞系中的表達(dá)并拍照。
　　 四、腦膠質(zhì)瘤組織芯片的構(gòu)建
　　 提取腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,進(jìn)行石蠟包埋并進(jìn)行HE染色,根據(jù)世界衛(wèi)生組織2000年的分類系統(tǒng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)重新診斷并且與病理結(jié)果比較,由神經(jīng)病理學(xué)家選取代表性

12、的腫瘤區(qū)域,構(gòu)建組織微陣列芯片。手術(shù)切除的正常腎臟組織作為陽性對照。
　　 五、腦膠質(zhì)瘤組織芯片免疫組織化學(xué)染色
　　 4um組織芯片切片在65℃烤30分鐘,二甲苯脫蠟和水化后,切片浸入乙二胺四乙酸的緩沖液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù),然后經(jīng)過3％過氧化氫.滅活內(nèi)源性過氧化物酶,1％胎牛血清封閉。抗人TLR9抗體,4℃孵育過夜。陰性對照,一抗為正常小鼠血清。人正常腎樣品作為陽性對照。根據(jù)免疫組化試劑盒說明,辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗

13、聚合物在室溫下孵育30分鐘,DAB顯色,蘇木素復(fù)染后封片。結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照分析。
　　 六、MTT法評估CpG-ODN對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響
　　 對數(shù)增長期的人腦膠質(zhì)瘤U87-MG、U251-MG和大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系接種到96孔板中。然后孵育讓細(xì)胞粘附,加入TLR9的激動劑ODN 2006,對照組加入ODN 2006 Control或相同體積的培養(yǎng)基。5mg/ml的MTT溶液過濾滅菌,不同時間點(diǎn)加入20

14、ul MTT。然后孵育4小時,吸凈培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜150μl,振蕩10分鐘充分溶解結(jié)晶后,選擇,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔在490nm波長處的光吸收值。
　　 七、Trallswell法測定CpG-ODN對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力的影響
　　 在具有直徑為8um微孔基底膜的小室內(nèi)預(yù)先鋪好基質(zhì)膠。1±104的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞連同200ul的培養(yǎng)基(含1％FBS)置于上室,下室置500μl的培養(yǎng)基(含20％FBS)。上下

15、室內(nèi)分別加入TLR9的激動劑ODN 2006,對照組加入ODN 2006Control或者相同體積的培養(yǎng)基,氯喹(10uM)作為TLR9的特異性阻斷劑。37℃孵育24小時后,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。在過濾器的下表面細(xì)胞用甲醇和冰醋酸混合物(3:1)固定30分鐘,風(fēng)干后吉姆薩染色。侵入的細(xì)胞數(shù)在任意5個200高倍鏡下視野觀察計數(shù),實驗重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 八、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 使用Windows SPS

16、S 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行所有的統(tǒng)計學(xué)分析。腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲實驗的組間比較使用t檢驗。TLR9的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤惡性分級的關(guān)聯(lián)使用Jonckheere-Terpstra檢驗,使用卡方檢驗進(jìn)行組間比較。構(gòu)建Cox回歸模型,多因素分析TLR9的表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人無進(jìn)展生存期的關(guān)系。用Kaplan-Meier方法構(gòu)建生存曲線,對數(shù)秩檢驗log-rank進(jìn)行組間比較。P≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 我

17、們的數(shù)據(jù)顯示,TLR9在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和腦膠質(zhì)瘤組織有表達(dá),而且TLR9在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是有功能的。TLR9識別含有CpG基序的寡核苷酸,在與配體結(jié)合后,TLR9的信號通路可能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生炎癥或微環(huán)境的變化。CpG-ODN可顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲力,我們證實是由CpG-ODN激活的TLR9信號傳導(dǎo)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的增加,這是因為TLR9的抑制劑氯喹能明顯抑制CpG-ODN誘導(dǎo)的U87細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)。應(yīng)用膠質(zhì)瘤組織芯片技術(shù),通過對