TM4SF1在膠質(zhì)瘤的表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的一類原發(fā)惡性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％～60％，至今仍然是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中預(yù)后最差的一類腫瘤。目前，膠質(zhì)瘤的治療通常是手術(shù)治療聯(lián)合放射治療和化學(xué)治療等綜合治療。近些年來，雖然在神經(jīng)影像技術(shù)、神經(jīng)顯微外科技術(shù)以及放射治療和化學(xué)治療等方面取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但是對于膠質(zhì)瘤患者而言，其手術(shù)以后的復(fù)發(fā)率仍然接近100％，中位生存時(shí)間不足1年。研究表明，低級別膠質(zhì)瘤的平均存活時(shí)間是3～5年，而高級別膠質(zhì)瘤

2、的平均存活時(shí)間是1～2年。雖然世界衛(wèi)生組織對膠質(zhì)瘤的分級標(biāo)準(zhǔn)至今仍然是評價(jià)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)，但是對于個(gè)體膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間的判斷而言，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)仍然有限。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤的分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，例如PTEN基因，可以作為一項(xiàng)獨(dú)立的因子來影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后生存時(shí)間，但是像這樣能夠獨(dú)立影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存時(shí)間的分子標(biāo)志物還比較少，因此需要發(fā)現(xiàn)更多的影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存時(shí)間的分子標(biāo)志物。
　　Transmembrane

3、-4-L-six-family-1(TM4SF1)，也被稱為腫瘤相關(guān)抗原L6(TAL6)，是四次跨膜蛋白家族成員之一，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)。目前將其歸入L6家族，其家族成員還包括TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18、TM4SF19、TM4SF20等。TM4SF1是在進(jìn)行肺癌的免疫治療時(shí)作為一種抗原被首次發(fā)現(xiàn)的，在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)其在許多上皮來源的腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等，并與這些腫瘤患

4、者的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)TM4SF1可促進(jìn)胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的遷移與侵襲，但具體相關(guān)機(jī)制尚未明確。
　　TM4SF1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)以及TM4SF1的表達(dá)程度與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)研究目前尚未見報(bào)道。因此，本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡以及實(shí)時(shí)定量qRT-PCR的方法，檢測了TM4SF1在對照腦組織和不同級別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的蛋白及mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量qRT-PCR以及蛋白免疫印跡的方法確認(rèn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T

5、M4SF1的表達(dá);并分析膠質(zhì)瘤患者的相關(guān)臨床因素，通過單因素以及多因素生存分析，探討這些臨床因素及TM4SF1的表達(dá)水平對患者預(yù)后生存時(shí)間的影響。
　　本文主要分三部分展開研究：
　　第一部分 TM4SF1在人腦膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)及其與病理分級的相關(guān)性
　　目的:確定TM4SF1在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，并分析TM4SF1的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級之間的相關(guān)性。
　　方法:1.組織標(biāo)本的收集:收集近期在河北醫(yī)科大學(xué)第二

6、醫(yī)院神經(jīng)外科住院并行手術(shù)切除的72例人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及8例對照腦組織標(biāo)本。膠質(zhì)瘤標(biāo)本均由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病理醫(yī)師確診，并依據(jù)2007年WHO分級對所有樣本進(jìn)行病理分級，作為對照組的8例腦組織取自腦出血或腦外傷需行內(nèi)減壓術(shù)的患者。每例組織分兩部分留取，一部分置于10％福爾馬林液中固定，另一部分保存于2ml無菌凍存管并立即投至液氮中速凍。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測72例人腦膠質(zhì)瘤組織及8例對照腦組織中TM4SF1的表

7、達(dá)，并分析其與病理分級的相關(guān)性。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法測定72例人腦膠質(zhì)瘤組織及8例對照腦組織中TM4SF1 mRNA的相對表達(dá)水平，并比較其表達(dá)差異。
　　4.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測72例人腦膠質(zhì)瘤組織及8例對照腦組織中TM4SF1蛋白的表達(dá)，并比較其表達(dá)差異。
　　結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)結(jié)果:TM4SF1在膠質(zhì)瘤組織中的陽性高表達(dá)率為52.78％(38/72

8、)，TM4SF1在8例對照腦組織中均無陽性表達(dá)，在各級別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中均可見到TM4SF1蛋白表達(dá)，與對照腦組織具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);低級別（Ⅰ、Ⅱ級）和高級別（Ⅲ、Ⅳ級）膠質(zhì)瘤組織陽性表達(dá)率分別為70.83％(17/24)和95.83％(46/48)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，TM4 SF1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，TM4SF1表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度存在正相關(guān)（rs=0.95，P＜0.05）。測量

9、各級別的人腦膠質(zhì)瘤組織與對照腦組織的平均光密度值(AOD)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，對照組、低級別膠質(zhì)瘤組和高級別膠質(zhì)瘤組之間存在顯著的差異性(P＜0.05)，且高級別膠質(zhì)瘤組與低級別膠質(zhì)瘤組的平均光密度值(AOD)均明顯高于對照組(P＜0.05)，高級別膠質(zhì)瘤組的平均光密度值(AOD)也明顯高于低級別膠質(zhì)瘤組(P＜0.05)。對膠質(zhì)瘤組織的細(xì)胞密度進(jìn)行的分析表明，高級別膠質(zhì)瘤組與低級別膠質(zhì)瘤組之間不存在顯著性差異。
　　2.qRT-PCR

10、結(jié)果:TM4SF1mRNA在對照腦組織、低級別膠質(zhì)瘤及高級別膠質(zhì)瘤中的相對表達(dá)量具有顯著性差異(P＜0.05)。與低級別膠質(zhì)瘤組(0.626±0.452)相比，高級別膠質(zhì)瘤組(2.117±0.618)的TM4SF1mRNA相對表達(dá)量升高了238.4％。
　　3.Westem blot結(jié)果:TM4SF1蛋白在對照腦組織、低級別膠質(zhì)瘤及高級別膠質(zhì)瘤中的相對表達(dá)量具有顯著性差異。與對照腦組織相比，TM4SF1蛋白在低級別級腦膠質(zhì)瘤中相對

11、表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與低級別級腦膠質(zhì)瘤相比，TM4SF1蛋白在高級別級腦膠質(zhì)瘤中相對表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對照腦組織相比，TM4SF1蛋白在高級別級腦膠質(zhì)瘤中相對表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.TM4SF1在人腦膠質(zhì)瘤組織中高度表達(dá)，且其表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理級別的升高而增加，高級別腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)要高于低級別腦膠質(zhì)瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、。
　　2.TM4SF1的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級別的升高呈顯著的正相關(guān)，提示TM4SF1能成為腦膠質(zhì)瘤臨床分級的重要分子標(biāo)志物。
　　第二部分 TM4SF1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251中的表達(dá)
　　目的:檢測TM4SF1在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251中的表達(dá)。
　　方法:1.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定U87和U251細(xì)胞株中TM4SF1 mRNA的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(W

13、estern blot)方法檢測U87和U251細(xì)胞株中TM4SF1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.qRT-PCR結(jié)果:在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251及作為陽性對照的結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116均檢測到了TM4SF1 mRNA的表達(dá)，數(shù)據(jù)分析表明，三組間TM4SF1 mRNA表達(dá)水平的差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Westem blot結(jié)果:在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251及作為陽性對照的結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116均檢

14、測到了TM4SF1蛋白的表達(dá)，數(shù)據(jù)分析表明，三組間TM4SF1蛋白表達(dá)的差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251中TM4SF1均表達(dá)陽性，二者表達(dá)程度無明顯差異。
　　第三部分 TM4SF1的表達(dá)水平及相關(guān)臨床因素與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的多因素生存分析
　　目的:探討影響腦膠質(zhì)瘤患者生存和預(yù)后的重要因素，從而更加準(zhǔn)確地判斷腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后情況，以便進(jìn)一步改善腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后。
　　方

15、法:查閱并記錄這72例膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料，分別了解這72例患者的性別、年齡、術(shù)前KPS評分、術(shù)前有無抽搐、腫瘤直徑、腫瘤術(shù)中切除范圍、腫瘤病理分級以及TM4SF1的表達(dá)程度。首先采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析，分別考察患者的相關(guān)臨床因素及TM4SF1的表達(dá)程度對存活時(shí)間的影響。差異的顯著性檢驗(yàn)采用Log-rank法。對單因素分析中P＜0.05者以前進(jìn)法(Forward:LR)進(jìn)行COX回歸多因素模型分析。
　　

16、結(jié)果:1.單因素分析結(jié)果:對選定的8項(xiàng)因子使用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析后發(fā)現(xiàn)，患者年齡、術(shù)前KPS評分、腫瘤切除范圍、腫瘤病理分級、TM4SF1的表達(dá)程度對于膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有影響，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.多因素分析結(jié)果:對Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的5項(xiàng)因子進(jìn)行多因素分析。以前進(jìn)法(Forward: LR)進(jìn)行COX回歸多因素模型分析后發(fā)現(xiàn)，腫瘤病理分級以及TM