蟾毒靈通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯在胰腺癌細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用.pdf

1、胰腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，在世界范圍內胰腺癌是癌癥相關死亡的重要原因。胰腺癌診斷后五年生存率僅約4％,80％～85％的胰腺癌患者在確診時已經(jīng)無法接受手術治療或者已經(jīng)發(fā)生轉移，導致了其較差的預后和較低的生存率。對于局部晚期或轉移性胰腺癌患者，以吉西他濱為基礎的聯(lián)合化療是主要的治療方式，然而大多數(shù)胰腺癌患者會對吉西他濱產(chǎn)生耐藥，這是導致胰腺癌化療失敗的重要原因。因此，迫切需要開發(fā)新型藥物來治療胰腺癌。
　　既往的基礎研究和臨床

2、試驗證明許多由傳統(tǒng)中草藥提取的自然物質如喜樹堿、長春花堿是有效抗腫瘤藥物，而這些藥物目前已經(jīng)被廣泛地應用于腫瘤的臨床治療，提示利用傳統(tǒng)中藥開發(fā)新型抗腫瘤藥物具有巨大的前景。蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取和分離的具有地高辛樣免疫活性的有效成分，既往研究表明蟾毒靈可以通過誘導細胞凋亡、周期阻滯或細胞自噬而抑制白血病、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、結腸癌等多種腫瘤細胞增殖。另有報道證明蟾毒靈可以增加骨肉瘤和肝癌細胞對常規(guī)化療藥物的敏感性。但是，

3、蟾毒靈對胰腺癌細胞的作用尤其是其作用機制尚未完全闡明，而目前亦缺乏關于蟾毒靈對胰腺癌化療敏感性影響的研究。
　　為了進一步闡明蟾毒靈對胰腺癌細胞的作用及可能的分子機制，并明確蟾毒靈對吉西他濱抗胰腺癌作用的影響，本論文進行了以下四部分研究工作。
　　第一部分蟾毒靈對胰腺癌PANC-1和CFPAC-1細胞增殖的影響
　　為了明確蟾毒靈對胰腺癌細胞增殖是否有抑制作用，我們選用PANC-1和CFPAC-1這兩株胰腺癌細胞為實驗

4、模型，以不同濃度的蟾毒靈(50nM，100nM，200nM，500nM，1000nM，2000nM)分別作用于這兩株細胞24h、48h和72h，設含0.1％DMSO細胞組為對照組，隨后以CCK-8法檢測細胞活性的改變。CCK-8結果顯示，蟾毒靈可以明顯抑制PANC-1及CFPAC-1細胞增殖，且這種抑制作用呈時間、濃度依賴性，即隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，細胞的增殖抑制率提高，細胞活性下降。
　　第二部分蟾毒靈對胰腺癌細胞

5、凋亡的影響及可能的分子機制
　　誘導細胞凋亡是很多抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞增殖的重要機制。我們知道，凋亡過程受到凋亡促進分子及凋亡抑制分子的共同調控，其中研究較多的凋亡抑制分子為Bcl-2，而凋亡促進分子為P53，其他與凋亡調控相關的分子有Bax、Bcr-abl及PML-RARα等。近年來，越來越多的報道證明熱休克蛋白可以通過調控凋亡信號通路中的關鍵分子發(fā)揮抗凋亡作用。Hsp27是小分子熱休克蛋白家族中的一員，它可以在不同的水平影響

6、內源性和外源性凋亡通路抑制細胞的凋亡促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，研究以Hsp27為靶點的藥物對腫瘤的治療具有重要意義。
　　如前所述，蟾毒靈可以在多種腫瘤細胞中通過調控不同的分子通路誘導細胞凋亡抑制腫瘤細胞的增殖，而最近的一項研究表明蟾毒靈可以通過靶向抑制Hsp27在骨肉瘤細胞中誘導凋亡。我們感興趣的是蟾毒靈對胰腺癌細胞凋亡的影響及其作用機制。因此，在該部分，我們選用PANC-1和CFPAC-1兩株胰腺癌細胞為模型，以不同濃度的蟾毒

7、靈(0nM，50nM，100nM，200nM)作用于胰腺癌細胞48h，以適當方法收集細胞，用流式細胞術檢測細胞凋亡率的改變;利用western blotting技術檢測PANC-1和CFPAC-1細胞中凋亡相關蛋白及其上游調控分子表達水平的改變。
　　流式檢測結果顯示，隨著藥物濃度的增加，PANC-1和CFPAC-1細胞的凋亡比率增加，即蟾毒靈可以誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡，進而抑制腫瘤細胞的增殖。Western blotting結果

8、表明，經(jīng)蟾毒靈處理后，Hsp27及其下游分子p-Akt在胰腺癌細胞中下調。同時，該研究證明，經(jīng)藥物處理后，pro-caspase-3和pro-caspase-9被激活，而Bax表達水平升高，Bcl-2表達下降，即Bax/Bcl-2的比值增高。根據(jù)上述實驗結果，我們推測蟾毒靈可能通過抑制Hsp27，進而調控其下游關鍵的凋亡相關蛋白最終引起細胞發(fā)生凋亡。
　　第三部分蟾毒靈對胰腺癌細胞周期分布及周期相關蛋白表達的影響
　　抗腫瘤

9、藥物可以通過誘導細胞周期阻滯而抑制細胞增殖，如放線菌素D、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、依托泊苷及長春新堿等。已有相關報道證明蟾毒靈可在肝癌、膀胱癌、子宮內膜癌等腫瘤細胞中引起細胞周期阻滯抑制細胞增殖活性。那么蟾毒靈是否可以在胰腺癌細胞中誘導細胞周期阻滯？為了闡明這一問題，我們利用PI單染流式細胞術檢測了不同濃度的蟾毒靈（0～200nM）處理胰腺癌細胞48h后，PANC-1和CFPAC-1細胞周期分布情況，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞被阻滯在G2/M期;Wes

10、tern blotting技術檢測了周期相關蛋白表達，結果顯示CyclinB1、CDK1表達水平下降，而p21蛋白表達水平升高。
　　既往的研究表明，CyclinB1、CDK1是G2/M周期檢測點的關鍵調控蛋白，而p21是CyclinB1-CDK1復合物的抑制分子。在本研究中，western blotting實驗結果證明蟾毒靈可以上調p21的表達及抑制CyclinB1、CDK1的表達。因此，我們認為蟾毒靈可能通過上調p21的水平及

11、抑制CyclinB1、CDK1的表達和活性使得胰腺癌細胞發(fā)生周期阻滯。但是，蟾毒靈誘導胰腺癌發(fā)生周期阻滯的具體分子機制有待于更多的研究進行闡明。
　　第四部分蟾毒靈在胰腺癌細胞中對吉西他濱的化療增敏作用
　　對于晚期和復發(fā)轉移胰腺癌來說，以吉西他濱為基礎的聯(lián)合化療是主要的治療方式，然而胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性的產(chǎn)生往往是治療失敗的主要原因之一。已有研究表明，蟾毒靈可以增加肝癌細胞和骨肉瘤細胞的化療敏感性，但是在胰腺癌中，蟾