微囊化VEGF基因修飾細(xì)胞移植促進(jìn)脫細(xì)胞真皮血管化的研究.pdf

1、皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)一直是外科領(lǐng)域不斷深入研究的課題,而理想的創(chuàng)面愈合應(yīng)含有真皮層結(jié)構(gòu)。目前已研究證實(shí)異種脫細(xì)胞真皮是較理想的真皮替代物,異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體薄皮片復(fù)合移植修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。異種脫細(xì)胞真皮的來(lái)源廣,成本低,有望在臨床上廣泛應(yīng)用。但不具備血管結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞真皮層血管化速度慢,這是導(dǎo)致其上方表皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏、局部感染和移植失敗的主要原因。因而促進(jìn)脫細(xì)胞真皮移植后的早期血管化是移植成功的關(guān)鍵。 在目前實(shí)

2、驗(yàn)研究中,為了提高移植皮片的存活能力,許多能誘導(dǎo)新生血管形成的生長(zhǎng)因子應(yīng)用于移植皮片的研究。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的因子,其促進(jìn)血管生成作用已得到認(rèn)可。但VEGF蛋白質(zhì)的半衰期較短,限制了臨床應(yīng)用。目前尚無(wú)一個(gè)完善的釋放傳遞系統(tǒng)以延長(zhǎng)VEGF與組織的接觸時(shí)間(即作用時(shí)間),讓其發(fā)揮最大的生物效應(yīng)。VEGF基因治療可克服單純蛋白質(zhì)治療的缺點(diǎn)

3、,因此人們考慮應(yīng)用VEGF基因治療。實(shí)踐中遇到的問題是導(dǎo)入的基因難以在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)；有些難以獲得有效基因轉(zhuǎn)移；而且還存在安全性問題；體外細(xì)胞增殖困難,自體細(xì)胞來(lái)源少及再移植后存活率低等。1993年加拿大的Sun和Chang最早提出了異體體細(xì)胞基因治療的策略,即將目的基因?qū)胍呀⒌募?xì)胞系內(nèi),使其表達(dá)基因產(chǎn)物,再將其移入病人體內(nèi)。這樣大大擴(kuò)展了細(xì)胞來(lái)源,但是免疫排斥反應(yīng)又限制了其應(yīng)用。微囊化細(xì)胞移植技術(shù)為解決這一問題提供了新方法,異體或異

4、種細(xì)胞微囊后移植可避免宿主的免疫排斥反應(yīng),同時(shí)可發(fā)揮分泌等功能。 20世紀(jì)80年代初,微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合,其特點(diǎn)在于選擇性透過(guò)膜,可避免免疫系統(tǒng)對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞的攻擊,起到免疫隔離作用,而小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物可自由出入。之后,微囊化細(xì)胞技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)和臨床研究,并已取得可喜成績(jī)。至90年代,隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展,人們嘗試以微囊作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具,利用基因修飾的異

5、體或異種細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能,治療相關(guān)疾病。 微囊化基因工程細(xì)胞技術(shù)是將微囊化技術(shù)與基因工程細(xì)胞技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,使基因工程細(xì)胞即基因修飾細(xì)胞借助微囊的免疫隔離作用在受體體內(nèi)長(zhǎng)期存活,并持續(xù)表達(dá)目的蛋白,有助于克服傳統(tǒng)基因工程藥物半衰期短,活性不高等缺點(diǎn),相對(duì)于基因治療則具有不改變受體基因組,更加安全,且可以批量生產(chǎn),凍存后隨時(shí)移植給所需患者,有降低工作量與成本的優(yōu)點(diǎn)。所以理論上將微囊化技術(shù)與基因工程技術(shù)及組織移植技術(shù)相

6、結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)VEGF基因的方式使囊內(nèi)細(xì)胞具有分泌VEGF的功能,可促進(jìn)移植組織血管化。然而,微囊化VEGF基因修飾細(xì)胞能否在創(chuàng)面異種真皮移植中起到加快早期血管化作用,目前國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。為此本文設(shè)計(jì)了本課題實(shí)驗(yàn),進(jìn)行了以下四個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分:hVEGF165基因重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建攜帶人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-165(hVEGF165)基因的重組腺病毒載體(Ad.VEGF),為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染、微囊化

7、基因修飾細(xì)胞制備等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將pAxCAwt.hVEGF165與DNA-TPC共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,擴(kuò)增后獲得載hVEGF165基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。使用PCR、酶切證實(shí)重組腺病毒中的目的基因。并根據(jù)半數(shù)組織感染量(TCID50)法計(jì)算病毒滴度。 結(jié)果：采用脂質(zhì)體法可使pAxCAwt.VEGF165與DNA-TPC有效轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,擴(kuò)增出載hVEGF165基因的復(fù)制缺陷型重組腺

8、病毒。PCR的產(chǎn)物進(jìn)行NcoI酶切鑒定,可得到597bp、146bp兩個(gè)片段,與GeneTool軟件理論上計(jì)算的結(jié)果完全一致。計(jì)算病毒滴度為2.2×1012pfu/ml。 結(jié)論：成功構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.VEGF165,其滴度高,毒性低,效率高,體外轉(zhuǎn)染安全。 第二部分：腺病毒介導(dǎo)hVEGF165基因體外感染NIH3T3細(xì)胞 目的：探討腺病毒介導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hVEGF165)基因轉(zhuǎn)染NIH3T

9、3細(xì)胞后目的基因表達(dá)情況及對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖分化的影響。 方法：應(yīng)用Ad.VEGF感染傳代培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞后,用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果和轉(zhuǎn)染率,免疫組化、RT-PCR和EIASA方法分別檢測(cè)hVEGF165基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后VEGF的表達(dá)情況,MTT檢測(cè)細(xì)胞增值活性。 結(jié)果：腺病毒介導(dǎo)的hVEGF165基因?qū)τ贜IH3T3細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率與病毒感染復(fù)制數(shù)(multiplidt

10、ies ofinfection,MOI)具有量效關(guān)系。MOI為100倍時(shí),轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％,轉(zhuǎn)染VEGF后,RT-PCR、免疫組化顯示NIH3T3細(xì)胞可有效表達(dá)VEGF,ELISA示7d時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰(1052 pg/mL),13d后仍可檢測(cè)到VEGF的表達(dá)。兩周內(nèi)采用MTT動(dòng)態(tài)檢測(cè)OD值,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的hVEGF165基因可以有效的轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,NIH3T

11、3細(xì)胞是一種較理想的基因載體細(xì)胞,其攜帶的VEGF基因可獲得較高的表達(dá)水平。 第三部分：微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞的制備及體外培養(yǎng) 目的：制備微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞,并研究微囊化技術(shù)對(duì)VEGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞增殖與活性及代謝分泌功能的影響。 方法：應(yīng)用純化海藻酸鈉.氯化鋇技術(shù)制備微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞,并與未微囊化細(xì)胞對(duì)照培養(yǎng),在倒置相差顯微鏡下觀察微囊及細(xì)胞形

12、態(tài),用MTT和PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖及活性情況,并每48h更換和收集微囊化和未微囊化基因修飾NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液,-20℃保存,通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液VEGF的含量,兩組進(jìn)行對(duì)比分析。 結(jié)果：微囊形態(tài)較圓整,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,兩組細(xì)胞增殖與活性及培養(yǎng)液中VEGF的含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論：微囊化并不影響基因修飾細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝功能,與對(duì)照組比較,在體外培養(yǎng)時(shí)生物學(xué)特性無(wú)明顯差異,從而為研究微

13、囊化基因修飾細(xì)胞體內(nèi)移植打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分：微囊化VEGF基因修飾細(xì)胞移植促進(jìn)脫細(xì)胞真皮血管化 目的：探討微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞移植對(duì)豬脫細(xì)胞真皮早期血管化及其復(fù)合皮存活的影響,從而探討其應(yīng)用于創(chuàng)面促進(jìn)豬脫細(xì)胞真皮血管化的可行性。 方法：以豚鼠背部急性皮膚全層缺損創(chuàng)面為模型,且對(duì)稱性分為4個(gè)區(qū),按移植物不同分為四組：微囊化VEGF-NIH3T3+復(fù)合皮移植組(A組)、未微囊化VEGF-NIH

14、3T3+復(fù)合皮移植組(B組)、空囊+復(fù)合皮移植組(C組)、PBS空白對(duì)照+復(fù)合皮移植組(D組)。觀察移植一周后微囊化細(xì)胞及未微囊化細(xì)胞在組織中病理形態(tài)改變；一周后ADM微血管化程度和兩周后復(fù)合皮的存活率；術(shù)后3,7,14天取脫細(xì)胞真皮組織,采用免疫組化SP法檢測(cè)hVEGF與CD34的表達(dá),并計(jì)算微血管密度(microvessel density,MVD),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：微囊化基因修飾細(xì)胞移植一周后微囊形態(tài)較好,細(xì)胞有增

15、值現(xiàn)象,囊周圍無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),而未微囊化基因修飾細(xì)胞周圍有明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。一周后大體解剖及病理切片顯示,A組血管化程度明顯強(qiáng)于B組。兩周后A組皮片存活率(91±7％)明顯高于其他三組(B,C,D組分別為79±5％,76±2％,77±4％)(P<0.01),B、C、D三組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。移植后的3,7,14天A組hVEGF及CD34表達(dá)明顯強(qiáng)于其他三組,且7,14天MVD明顯高于其他三組(P<0.01),而其他三組之

16、間無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)。 結(jié)論：微囊化基因修飾細(xì)胞移植可促進(jìn)創(chuàng)面異種脫細(xì)胞真皮早期血管化,提高復(fù)合皮片存活率,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。 綜上所述,本研究初步證實(shí)了微囊化基因修飾細(xì)胞制備的可行性,在體外培養(yǎng)微囊內(nèi)細(xì)胞增值活性好,VEGF穩(wěn)定表達(dá)。體內(nèi)植入可促進(jìn)創(chuàng)面脫細(xì)胞真皮早期快速血管化,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。可以期待,隨著微囊化和基因工程技術(shù)的不斷深入研究,必將產(chǎn)生一系列成果,為組織移植及難愈創(chuàng)面的血管化提供新的臨床治療策略