AML1b和AML1-ETO對pig7基因的轉錄調節(jié)及pig7基因對白血病細胞增殖活性影響的研究.pdf

1、研究目的：觀察AML1b基因及其融合基因AML1—ETO對pig7基因啟動子轉錄活性的影響，探討AML1與pig7的相互作用在白血病發(fā)生中的機制，并通過功能性實驗闡釋pig7對白血病細胞增殖活性的影響。 研究方法：AML1b和AML1—ETO表達質粒分別轉染及共轉染CV—1和293細胞，用Realtime-PCR方法檢測上述基因對兩種細胞內源性pig7基因mRNA表達水平的影響；構建含AML1b結合位點的pig7基因增強子序列以

2、及相對應的突變位點的熒光素酶報告基因質粒；將表達載體/突變載體與AML1b或(和)AML1—ETO基因瞬時共轉染CV—1細胞，分析AML1b、AML1—ETO對報告基因的轉錄調節(jié)作用。構建含有pig7開放讀碼框(ORF)的慢病毒表達載體pCDH-Pig7及含有pig7反義片段的慢病毒表達載體pCDH—anti-Pig7，并分別導入白血病細胞，表達pig7基因及干擾RNA片段，研究該基因的生物學功能。 結果：轉染AML1b的兩種細

3、胞系，其內源性pig7基因mRNA表達水平均明顯上調；含有轉錄起始位點上游1511至1503的TTTGTGGAT序列的熒光素酶報告基因質粒的表達活性與共轉染的AML1b質粒劑量呈明顯的“劑量—效應”關系，熒光素酶表達活性上調最高達3倍(P<0.05)；而AML1—ETO在不同劑量條件下對熒光素酶表達活性調節(jié)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在一定劑量范圍內，共轉染的AML1—ETO可拮抗AML1b的調節(jié)作用。應用pCDH慢病毒系統(tǒng)成功構建

4、并包裝出pCDH-Pig7慢病毒及pCDH—anti-Pig7慢病毒，體外感染白血病細胞系Kasumi—1和NB4后，在細胞高表達pig7蛋白的同時，Kasumi—1細胞出現(xiàn)明顯的凋亡和分化趨勢，而NB4細胞增殖率并無明顯變化，但聯(lián)合應用藥物全反式維甲酸(ATRA)作用于NB4細胞后，也表達出明顯的促凋亡和分化作用(P<0.05)；當細胞內源性pig7表達受到抑制的同時，Kasumi—1及NB4細胞均對藥物表現(xiàn)出不同程度的耐受性(P<0