釀酒酵母生產(chǎn)白藜蘆醇關(guān)鍵酶基因4CLcDNA的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、白藜蘆醇是一種植物抗毒素，具有抗菌、抗氧化、保護心血管、抗癌等許多藥理作用?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)。目前生產(chǎn)白藜蘆醇還主要是植物提取法，但在自然條件下，植物體內(nèi)白藜蘆醇的含量很低，限制了白藜蘆醇的產(chǎn)量。所以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)白藜蘆醇逐漸受到人們的重視。由于釀酒酵母具有生長速度快、對培養(yǎng)基要求低并且生產(chǎn)過程中不產(chǎn)生毒素等優(yōu)點，利用重組釀酒酵母生產(chǎn)白藜蘆醇是一條有效途徑。 但由于釀酒酵母體內(nèi)缺少白藜蘆醇生物合成過

2、程中的另一關(guān)鍵酶，4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)。所以應(yīng)首先將4CL基因通過基因工程手段轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細胞。 本研究利用TRIzol法獲得擬南芥總RNA，通過RT—PCR法克隆出4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(4CL)cDNA序列，并構(gòu)建了重組穿梭載體pESC-HIS-4CL。用pESC—HIS-4CL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，通過氨芐青霉素抗性篩選出重組大腸桿菌。提取重組大腸桿菌中的質(zhì)粒后，通過PCR和雙酶切鑒定，對其進行序列