日本血吸蟲生殖相關(guān)基因SjWD40的克隆表達(dá)及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的：將在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、發(fā)育和信號(hào)通路等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用的WD40蛋白家族作為研究的對(duì)象，從GenBank中現(xiàn)有的日本血吸蟲基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了功能尚未證實(shí)的WD40蛋白家族成員SjWD40，對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并通過(guò)基因工程的方法獲得重組蛋白，制備特異性抗體，對(duì)該基因在血吸蟲不同階段的表達(dá)和組織定位進(jìn)行研究，確定它在蟲體哪個(gè)組織器官中表達(dá)，初步推測(cè)它主要在哪方面發(fā)揮生物學(xué)功能，并評(píng)價(jià)該重組蛋白是否具有免疫學(xué)價(jià)

2、值。 方法：SjWD40基因的生物信息學(xué)分析；SjWD40基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性分析；SjWD40在蟲體的各個(gè)階段和組織中表達(dá)的研究。 結(jié)果：①SjWD40基因的生物信息學(xué)分析。Blastx分析該基因具有完整的開放閱讀框，基因全長(zhǎng)1086bp，編碼區(qū)為66-950，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA，編碼294個(gè)氨基酸，理論分子量和等電點(diǎn)分別是31.8kDa和6.44。PredictProtein預(yù)測(cè)該序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

3、中α螺旋(H)、β折疊(E)和無(wú)規(guī)則卷曲(L)的比例分別是0:55.78:44.22。Motifscan預(yù)測(cè)該蛋白含有一個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，1個(gè)CAMP磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)潛在的N—肉豆蔻酰位點(diǎn)。InterProScan顯示該蛋白含有6個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能是WD40蛋白家族中的一員，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)

4、節(jié)、細(xì)胞增殖等方面起到重要的作用。②SjWD40基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性分析。設(shè)計(jì)引物從日本血吸蟲cDNA中擴(kuò)增SjWD40目的片段，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA條帶在885bp左右，定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET—28a(+)—SjWD40經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白，經(jīng)SDS—PAGE顯示與理論預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性、親和層析純化，獲得日的蛋白。③S

5、jWD40在蟲體的各個(gè)階段和組織中表達(dá)的研究。提取日本血吸蟲雌蟲、雄蟲、蟲卵、尾蚴的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA，采用RT—PCR對(duì)SjWD40編碼基因在不同蟲期的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SjWD40基因在不同發(fā)育期均有轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異。 結(jié)論：⑴從GenBank中現(xiàn)有的日本血吸蟲基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了功能尚未證實(shí)的WD40蛋白家族成員SjWD40，該蛋白含有6個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域，屬于WD蛋白家族中的一員，

6、利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了pET—28a(+)—SjWD40原核表達(dá)載體，得到純化的重組蛋白。⑵Western Blotting結(jié)果表明該重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性。應(yīng)用ELISA方法，比較重組抗原和成蟲粗抗原檢測(cè)日本血吸蟲病人血清IgG敏感性表明，該重組蛋白與粗制的SjAWA具有相似的敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性，提示rSjWD40抗原可以用作日本血吸蟲病的診斷抗原。⑶SjWD40在日本血吸蟲生活史各時(shí)期均有表達(dá)，定位于日本