日本血吸蟲8kD鈣結(jié)合蛋白（SjCa8）的表達(dá)及其免疫學(xué)特征的研究.pdf

1、血吸蟲病是一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)牛問題，在非洲、中東、南美洲和東南亞流行地區(qū)，超過6億人口受到共計(jì)6種血吸蟲感染的威脅，超過2億人口被感染，預(yù)計(jì)每年至少2萬人死于血吸蟲病。我國(guó)主要流行日本血吸蟲病，至2005年底，尚有七個(gè)省、市、自治區(qū)的105個(gè)縣流行日本血吸蟲病，血吸蟲患者仍高居798，762例；歷史上無螺區(qū)和一些基本消滅血吸蟲病的地區(qū)，疫情出現(xiàn)反彈，血吸蟲病患者及釘螺面積均有回升趨勢(shì)，我國(guó)現(xiàn)階段血吸蟲病防治任務(wù)仍異常艱巨。半個(gè)世紀(jì)以

2、來，經(jīng)過眾多研究者的不懈努力，我國(guó)血吸蟲病防治取得了舉世矚目的成就，但對(duì)血吸蟲病的早期診斷、有效疫苗研制及吡喹酮替代藥物開發(fā)等方面仍未取得實(shí)質(zhì)性突破，我國(guó)血吸蟲病防治形勢(shì)不容樂觀，徹底消滅血吸蟲仍尚待時(shí)日。因此有必要在總結(jié)前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從新角度出發(fā)利用新技術(shù)，尋求新的早期診斷分子、疫苗候選分子及新型治療藥物。 尾蚴是血吸蟲生活史中短暫的自由生活階段，也是感染終宿主的唯一時(shí)期。尾蚴結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，壽命短(1-3天)，既不攝取營(yíng)養(yǎng)

3、，又無細(xì)胞分裂，存活力較弱。研究表明，1)尾蚴混合抗原能作為血吸蟲病的早期診斷抗原，但由于來源困難不能大規(guī)模應(yīng)用，且其中有效成分仍未得到鑒定。2)紫外線致弱(減毒)尾蚴是目前誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生最強(qiáng)免疫保護(hù)力的疫苗，但取材困難、不安全，且作用分子機(jī)制及有效成分尚不知曉。3)雖然吡喹酮的作用靶標(biāo)仍是個(gè)“謎團(tuán)”，但吡喹酮能破壞血吸蟲體內(nèi)鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡已是不爭(zhēng)事實(shí)，而尾蚴的主要結(jié)構(gòu)頭腺和鉆腺中富含鈣離子及鈣相關(guān)蛋白。綜合眾多研究結(jié)果，以尾蚴為研究對(duì)

4、象尋求血吸蟲病早期診斷抗原，開發(fā)血吸蟲病有效疫苗，揭示吡喹酮的藥理機(jī)制及開發(fā)新型替代藥物將會(huì)取得血吸蟲病防治新的突破口。 基于前人研究基礎(chǔ)，我們對(duì)日本血吸蟲尾蚴特異性短程表達(dá)蛋白SjCa8進(jìn)行生物信息學(xué)分析、原核載體大量重組表達(dá)、純化與鑒定、生物活性檢測(cè)、在血吸蟲各期蟲體表達(dá)與分布檢測(cè)、抗原性分析與血吸蟲病早期診斷分子價(jià)值探討、免疫原性分析與抗血吸蟲感染疫苗價(jià)值評(píng)價(jià)等方面的研究。 SjCa8的生物信息學(xué)分析 SjCa8是

5、一個(gè)由69個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，理論等電點(diǎn)和分子量分別為5.16、7.7kD。氨基酸序列中具兩段鈣結(jié)合特征的EF-hand基序，分別位于氨基酸序列的15-27區(qū)、51-63區(qū)。氨基酸序列中7-14區(qū)、28-41區(qū)和43-52區(qū)為SjCa8的潛在抗原表位。對(duì)源自日本血吸蟲(Sj)、曼氏血吸蟲(Sm)、華支睪吸蟲(Cs)、肝片形吸蟲(Fh)、巴西利什曼原蟲(Lb)、小鼠(Mm)和人類(Hm)的Ca8氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)及種系進(jìn)化樹分

6、析發(fā)現(xiàn)，SjCa8與寄生蟲Ca8的相似性高于哺乳動(dòng)物Ca8與SmCa8相似性最高(86.96％)，與MmCa8的相似性最低(30％)。純化SjCa8的制備與鑒定SjCa8在原核載體pET32a(+)中的最佳表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度：37℃；IPTG終濃度：0.4mM；誘導(dǎo)時(shí)間：6h。在此條件下，SjCa8主要以可溶性蛋白形式融合表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白量的28％。融合SjCa8經(jīng)柱層析、酶切和透析凍干處理，可獲得與預(yù)期大小一致的純化SjC

7、a8，并經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS鑒定確認(rèn)。 SjCa8的Ca<'2+>結(jié)合活性檢測(cè)經(jīng)EMSA分析，重組表達(dá)SjCa8具有良好生物活性，具有鈣結(jié)合能力，可用于下一步的研究。 SjCa8在血吸蟲生活史不同蟲期中的表達(dá)RT-PCR及Western-blot均證明，SjCa8特異性表達(dá)于血吸蟲尾蚴階段，在雄性成蟲、雌性成蟲及蟲卵中未見表達(dá)；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SjCa8只能在逸出釘螺3h內(nèi)的尾蚴中檢測(cè)到，說明SjCa8是

8、尾蚴特異性短程表達(dá)蛋白。 SjCa8在尾蚴中的組織定位免疫熒光檢測(cè)尾蚴蟲體、組織冰凍切片發(fā)現(xiàn)，SjCa8主要分布于血吸蟲尾蚴的頭腺和鉆腺中，其他部分未有明顯分布。預(yù)示SjCa8與尾蚴頭腺、鉆腺的功能密切相關(guān)，即在尾蚴尋找宿主、吸附宿主皮膚、入侵宿主皮膚及侵入皮膚過程中尾蚴體膜修復(fù)等生命活動(dòng)中扮演重要角色。 SjCa8的抗原性及其血吸蟲病早期免疫診斷價(jià)值探討SjCa8屬于尾蚴特異性短程表達(dá)蛋白，但在血吸蟲感染初期，宿主體內(nèi)

9、并不能檢測(cè)到相應(yīng)特異性抗體，而且，以SjCa8診斷血吸蟲感染、肝吸蟲感染、弓形蟲感染及廣州管圓線蟲感染時(shí)出現(xiàn)不同程度的交叉反應(yīng)，顯示SjCa8并非血吸蟲病早期免疫診斷的理想候選分子。 SjCa8的免疫原性及其抗血吸蟲感染作用的考核利用SjCa8免疫Balb/c小鼠2-3次，可在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到滴度高達(dá)1：2000的特異性抗體，證實(shí)SjCa8具有較好的免疫原性。動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)顯示：SjCa8免疫后可誘導(dǎo)小鼠獲得35.31％的減蟲率和

10、35.68％的肝減卵率，SjCa8具有抗血吸蟲感染疫苗開發(fā)的廣闊前景。經(jīng)SjCa8處理的髓源性樹突狀細(xì)胞(BMDC)，CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ類分子表達(dá)水平顯著升高，CD11c的表達(dá)未見明顯變化，表明SjCa8能有效促進(jìn)BMDC的分化成熟，從而可以進(jìn)一步激活機(jī)體特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。綜上所述，我們成功表達(dá)并純化了具有鈣結(jié)合活性的SjCa8，研究證實(shí)SjCa8為逸出釘螺3h內(nèi)尾蚴特異性短程表達(dá)蛋白，分布于尾蚴頭腺、鉆腺中；