日本血吸蟲Mago nashi基因的克隆、表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、血吸蟲病目前仍是危害人畜健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。在我國(guó)，日本血吸蟲病雖經(jīng)數(shù)十年防治，投入大量人力和財(cái)力，疫情仍時(shí)有反復(fù)，防治效果難以鞏固。血吸蟲致病主要由于性成熟成蟲所產(chǎn)的蟲卵在人畜肝臟大量沉積形成蟲卵肉芽腫，另一方面，沉積在腸壁的蟲卵排出體外是造成該病流行傳播的重要途徑。因此，控制血吸蟲性別分化、性成熟及雌蟲產(chǎn)卵成為防制血吸蟲病的重要策略，其中血吸蟲性別特異性表達(dá)產(chǎn)物及功能研究，對(duì)血吸蟲生殖發(fā)生與發(fā)育的深入了解及抗血吸蟲新藥研制都

2、有重要實(shí)際意義。RNA干擾(RNAi)技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)以其高特異性、高效性、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)目前已經(jīng)運(yùn)用于血吸蟲基因功能的研究。我們選擇從本室建立的日本血吸蟲童蟲cDNA文庫(kù)中篩選出的與模式生物調(diào)節(jié)雌雄同體性別決定蛋白即決定生殖細(xì)胞雄性化作用的Mago nashi樣蛋白基因(Genebank登錄號(hào)BM735619)作為靶基因，構(gòu)建表達(dá)小發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒pSUPER的RNAi系統(tǒng)，為運(yùn)用RNAi技術(shù)鑒定該基因在日本血吸蟲性別發(fā)

3、育和生殖功能奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)日本血吸蟲Mago nashi樣蛋白基因(序列號(hào)為BM735619)作為shRNA的目的基因，利用 www．a(chǎn)mbion．com/techlib/misc在線軟件獲得目的序列，經(jīng)BLAST分析無(wú)同種屬物種同源序列，分別選取第193-211堿基序列為M1及第464-482堿基序列為M2的特異針對(duì)日本血吸蟲Mago nashi樣蛋白基因序列。陰性對(duì)照根據(jù)M1編碼序列隨機(jī)重排并經(jīng)BLAST分析無(wú)同種屬物種同

4、源性序列的1對(duì)堿基序列為R。在shRNA兩端分別加上 BglⅡ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)，選取的特異堿基序列與其互補(bǔ)序列之間連以9個(gè)核苷酸環(huán)，每條鏈shRNA核苷酸為64個(gè)。正向序列：GATCCCC N19 TTCAAGAGA N’19 TTTTTGGAAA，反向序列：AGCTTTTCCAAAAA N19TCTCTrGAA N’19 GGG，其中N19即所選特異堿基正向序列，N’19即其反向序列。將設(shè)計(jì)好的6條寡核苷酸序列交由生物技術(shù)公司合

5、成。合成后寡核苷酸通過(guò)退火形成雙鏈DNA片段，將其與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BgIⅡ和HindⅢ雙酶切的pSUPER質(zhì)粒連接，構(gòu)建表達(dá)shRNA的重組質(zhì)粒。由于重組質(zhì)粒BglⅡ酶切位點(diǎn)喪失，我們選擇HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定?？召|(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后被切下的小片段應(yīng)為227bp，而重組質(zhì)粒因插入64bp則被切下的小片段應(yīng)為291bp。經(jīng)酶切及測(cè)序證實(shí)pSUPER構(gòu)建成功后，純化重組pSUPER。在BTX電穿孔儀上，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后確

6、定參數(shù)為120V電壓、20ms脈沖時(shí)值、1次脈沖次數(shù)，將RNAi質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染機(jī)械化制備日本血吸蟲童蟲體內(nèi)，體外培養(yǎng)并分別于電穿孔后第1，3，5天收集童蟲，按TRIzol方法同時(shí)提取童蟲的總RNA、DNA及總蛋白。首先以轉(zhuǎn)染的血吸蟲童蟲DNA為模板，PCR方法擴(kuò)增表達(dá)shRNA質(zhì)粒中的片段以確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成功；再經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting分別檢測(cè)Mago nashi基因表達(dá)水平變化。另外，按相同方法制備的電穿

7、孔R(shí)NAi質(zhì)粒童蟲分別肌肉注射BALB/c小鼠兩后大腿外側(cè)，飼養(yǎng)6周后剖殺小鼠獲取血吸蟲成蟲，制備成蟲整體標(biāo)本置普通顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察血吸蟲形態(tài)及生殖器官結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mago nashi基因的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)驗(yàn)組分別于電穿孔后第1，3，5天較對(duì)照組(pSUPER-R組)分別下降了7％，68％，81％(pSUPER-M1組)及27％，41％，66％(pSUPER-M2組)。該基因的蛋白水平在第1，3，5天較對(duì)照組(pSUPE

8、R-R組)分別下降了15％，25％，54％(pSUPER-M1組)及18％，28％，42％(pSUPER-M2組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示由哺乳動(dòng)物 H1 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的shRNA可以特異性抑制日本血吸蟲靶基因和蛋白的表達(dá)，短期內(nèi)(1-5天)效果明顯。雖然經(jīng)小鼠體內(nèi)獲得用RNAi質(zhì)粒注射的血吸蟲成蟲形態(tài)大小及主要生殖器官的大小，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯變化。但在共聚焦顯微鏡下可以觀察到其形態(tài)結(jié)構(gòu)的微細(xì)變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組部分雄蟲睪丸內(nèi)細(xì)胞排列緊