日本血吸蟲疫苗聯(lián)合應(yīng)用及體內(nèi)電穿孔技術(shù)的研究.pdf

1、血吸蟲病仍然是一種嚴重危害流行區(qū)人民健康的重要公共衛(wèi)生問題。我國每年要投入大量的人力、物力和財力防治血吸蟲病，雖取得了一定的效果，但由于血吸蟲保蟲宿主多，中間宿主釘螺分布廣且難以消滅，再感染頻繁發(fā)生，血吸蟲病的流行形勢仍十分嚴峻。上世紀70年代吡喹酮的問世，對血吸蟲病具有良好的治療效果，DNA疫苗作為一種劃時代的新技術(shù)，在抗血吸蟲感染領(lǐng)域已進行了大量研究，顯示了良好的應(yīng)用前景。本實驗室已構(gòu)建了日本血吸蟲(中國大陸株)磷酸丙糖異構(gòu)酶(TP

2、I)和23kDa膜蛋白的DNA疫苗，同時還構(gòu)建了TPI和日本血吸蟲抗獨特型抗體NP30 CDR3區(qū)6倍重復(fù)表位基因(CDR3)6的雙價DNA疫苗，均在動物實驗中取得一定的保護作用，但保護力并不理想，減蟲率均未穩(wěn)定達到50％以上。本研究擬通過制備日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗，并通過兩者聯(lián)合免疫觀察免疫保護效果；在此基礎(chǔ)上再應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)來提高雞尾酒式DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率，以進一步提高其免疫保護效果，同時對其作用的機理進行初步

3、探討。研究內(nèi)容主要包括：一、日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強免疫保護作用的研究大量制備質(zhì)粒DNA：pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-SjC23、pcDNA 3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR 3)6，同時制備重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30。以質(zhì)粒DNA pcDNA 3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即為雞尾酒式DNA疫苗；

4、重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30等量混合后即為雞尾酒式蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠隨機分為A、B、C、D、E5組，每組14只。A組為自然感染組；B組(空質(zhì)粒對照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μ1 pcDNA3.1質(zhì)粒DNA；C組(空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質(zhì)粒DNA，第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μ1雞尾酒式蛋白疫苗+1

5、00μ1福氏完全佐劑(FCA)；D組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗；E組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μlFCA。DNA免疫組末次免疫后4周，蛋白加強組末次免疫后2周，所有小鼠同時經(jīng)腹部皮膚感染40±1條日本血吸蟲尾蚴。攻擊感染后42

6、 d剖殺，計數(shù)成蟲數(shù)及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a，感染前2d取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液，檢測脾細胞經(jīng)刀豆蛋白(ConA)和日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(SEA)刺激后細胞因子IL-2、IL-4、IFN—γ的水平。雞尾酒式DNA疫苗、雞尾酒式蛋白疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體，C、D組和E組的A450值分別為1.956±0.005、1.374±0

7、.810、2.162±0.162，與對照組相比，C、D、E組的IgG抗體水平均顯著升高(P均<0.01)，E組的IgG抗體水平顯著高于C組(P<0.05)和D組(P<0.01)，抗體亞類IgG2a/IgG1的比值分別為0.525、1.829和0.712。D、E兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ含量較空質(zhì)粒對照組均有明顯升高，IL-4則無明顯差異。本實驗表明，雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用，具有顯著的正協(xié)同作用，雞尾酒式蛋

8、白疫苗可顯著增強雞尾酒式DNA疫苗的免疫保護作用。二、體內(nèi)電穿孔增強日本血吸蟲核酸疫苗免疫保護作用的研究在第一部分實驗研究的基礎(chǔ)上，為進一步提高其免疫保護作用，擬通過采用體內(nèi)電穿孔的免疫方法，探討該免疫方法在提高免疫保護作用中的效能。制備雞尾酒式DNA疫苗和雞尾酒式蛋白疫苗同第一部分。70只BALB/c小鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組14只。A組為自然感染組；B組(電穿孔空質(zhì)粒對照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射

9、100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA，每次DNA注射后即輔以體內(nèi)電穿孔；C組(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)空質(zhì)粒免疫與體內(nèi)電穿孔同B組，但于第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA)；D組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿孔；E組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)雞尾酒式

10、DNA免疫與體內(nèi)電穿孔同D組，但于第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫組末次免疫后4周，蛋白加強組末次免疫后2周，所有小鼠同時經(jīng)腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42 d剖殺小鼠，計數(shù)成蟲及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a，并取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液，脾細胞經(jīng)ConA和SEA刺激后，采用流式細胞儀

11、檢測上清中細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，相對于對照組(A組)，C、D和E組的減蟲率分別為18.09％、45.00％和57.09％，D組和E組的減蟲率均顯著高于C組(P均<0.01)，且E組的減蟲率顯著高于D組(P<0.05)；C、D組和E組的減卵率分別為12.49％、50.88％和59.26％，D組和E組的減卵率均顯著高于C組(P均<0.01)，且E組的減蟲率顯著高于D組(P<0.05)。C、D、E 3組小鼠血

12、清都檢測到特異性IgG抗體，抗體亞類IgG2a/IgG1比值分別為0.394、3.518、0.914。D、E兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN—γ含量較對照組均有明顯升高，IL-4則無明顯差異。本實驗顯示，體內(nèi)電穿孔技術(shù)可顯著提高日本血吸蟲核酸疫苗的免疫保護作用。三、日本血吸蟲核酸疫苗體內(nèi)電穿孔法的進一步研究為進一步探索體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強血吸蟲核酸疫苗免疫保護作用的穩(wěn)定性、可靠性及可重復(fù)性，為此進行了重復(fù)性試驗，以進一步驗證該免疫

13、方法的可行性。日本血吸蟲“雞尾酒式”DNA疫苗和蛋白疫苗的制備同前。96只5—6周齡的BALB/c雌性小鼠隨機分成A、B、C、D、E、F、G、H8組，每組12只，其中A組(空質(zhì)粒對照組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA；B組(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA，每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿

14、孔，于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA)；C組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗；D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA；E組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組

15、)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA免疫后即進行體內(nèi)電穿孔；F組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA免疫后即進行體內(nèi)電穿孔，但于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA；G組(TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μlpcDN

16、A3.1-SjCTPI質(zhì)粒DNA；H組(電穿孔TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μlpcDNA3.1-SjCTPI質(zhì)粒DNA，每次DNA免疫后即進行體內(nèi)電穿孔。DNA疫苗末次免疫后4周，蛋白疫苗加強免疫后2周，所有小鼠同時經(jīng)腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42d剖殺小鼠，計數(shù)各小鼠成蟲數(shù)和肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2

17、a，并取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液，脾細胞經(jīng)ConA和SEA刺激后，采用流式細胞儀檢測上清中細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果與上次實驗基本相符，B—H實驗組的減蟲率分別為14.77％、32.54％、43.95％、41.47％、59.38％、27.23％和42.37％，相對于對照組(A組)檢獲的成蟲數(shù)均顯著降低(P均<0.01)，D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)的減蟲率顯著高于C組(雞尾酒式DNA疫苗組)和B組

18、(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗對照組)(P值分別為<0.01和<0.05)，經(jīng)SEA特異性刺激后，各實驗組的IL-2和IFN-γ水平較對照組明顯升高，而IL-4則未檢測到。本研究再次表明，DNA疫苗通過體內(nèi)電穿孔再結(jié)合蛋白疫苗的聯(lián)合應(yīng)用可較大程度的提高免疫保護作用，減蟲率、減雌率及肝臟的減卵率均達到接近60％和60％以上，表明該免疫方法具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，是一種較理想而且可行的血吸蟲病免疫策略。進一步的研究將進行大動物保護性試