日本血吸蟲(chóng)未成熟卵單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及在疫苗研究中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景： 血吸蟲(chóng)病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病。成熟蟲(chóng)卵是血吸蟲(chóng)病的主要致病因素和傳播血吸蟲(chóng)病的唯一因子。因此血吸蟲(chóng)病疫苗的研究主要集中于抗雌蟲(chóng)生殖、抗卵胚發(fā)育方面。 近十余年來(lái)，課題組的研究已經(jīng)證明：未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原(SIEA)免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育和抗雌蟲(chóng)生殖產(chǎn)卵的效果，SIEA誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，在抗血吸蟲(chóng)病保護(hù)性免疫中起重要作用。抗SIEA免疫血清不僅與蟲(chóng)卵內(nèi)胚胎結(jié)合，抑制和干擾卵胚的發(fā)育過(guò)程；而且

2、還與雌蟲(chóng)卵黃腺及緊鄰卵黃腺的腸腔內(nèi)膜組織結(jié)合，使雌蟲(chóng)的生殖產(chǎn)卵功能受到影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SIEA26-28kDa抗原分子是誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)成分之一；但是SIEA26-28kDa天然分子分離純化與批量制備困難，一直是困擾天然分子疫苗應(yīng)用的難題。因此，通過(guò)獲得高度特異性SIEA26-28kDa抗體作為探針篩選、分析并鑒定天然分子候選疫苗SIEA26-28kDa相關(guān)的編碼基因，或許是解決問(wèn)題的途徑之一。近幾年來(lái)，噬菌體單鏈

3、抗體技術(shù)的發(fā)展，為快速獲得具有與完整抗體相同抗原結(jié)合功能的單鏈抗體(scFv)提供了方便。 研究目的： 本研究旨在獲得與日本血吸蟲(chóng)天然分子候選疫苗SIEA26-28kDa特異性結(jié)合的單鏈抗體，借此特異性單鏈抗體為探針篩選日本血吸蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，以期獲得天然分子候選疫苗相應(yīng)的編碼基因。 研究方法： (1)應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)未成熟卵單鏈抗體庫(kù)，以SIEA免疫BALB/C小鼠，提取小鼠脾臟總RNA

4、，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以小鼠免疫球蛋白H鏈和L鏈可變區(qū)簡(jiǎn)并引物，cDNA第一鏈為模板，分別擴(kuò)增出H鏈和L鏈可變區(qū)基因。SOE-PCR法將VH和VL片段隨機(jī)拼接成scFv片段，然后將scFv片段克隆至pCANTAB5E載體，并電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TG1菌，經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救，獲得SIEA噬菌體展示單鏈抗體庫(kù)。測(cè)定單鏈抗體庫(kù)的庫(kù)容、重組率和多樣性。 (2)以分離純化SIEA26-28kDa，天然分子抗原為

5、靶，對(duì)單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行四輪富集，運(yùn)用集落挖掘法或EIASA法篩選針對(duì)SIEA26-28kDa分子的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆感染大腸桿菌HB2151，使可溶性單鏈抗體表達(dá)。SDS-PAGE，Westem blot分別鑒定單鏈抗體的表達(dá)水平、分子量以及與SIEA26-28kDa的結(jié)合活性和特異性。 (3)為了提高SIEA26-28kDa單鏈抗體的可溶性表達(dá)量，將特異性SIEA26-28kDa scFv基因序列克隆至PET32a原核表達(dá)載體

6、，構(gòu)建PET32a/scFv原核表達(dá)質(zhì)粒；另一方面，為獲得EGFP標(biāo)記的scFv，擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因，克隆至PET32a/scFv質(zhì)粒，構(gòu)建PET32a/EGFP-scFv質(zhì)粒。然后將原核重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在大腸桿菌中誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE，Western blot分析確定單鏈抗體融合蛋白Trx-scFv和Trx-EGFP-scFv的表達(dá)水平、分子量以及與SIEA26-28k

7、Da的結(jié)合活性和特異性。Trx-EGFP-scFv融合蛋白與日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵組織切片孵育，熒光顯微鏡觀察GFP信號(hào)以評(píng)價(jià)特異性單鏈抗體的靶向性。 (4)以高表達(dá)的特異性SIEA26-28kDa單鏈抗體為探針篩選日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆測(cè)序，通過(guò)NCBI的Blastn、Blastp程序進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)水平的同源性分析。 (5)以日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)作模板，擴(kuò)增SIEA26-28kDa天然分子

8、候選疫苗相關(guān)編碼基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，構(gòu)建pQE30原核重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌M15中，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE，Western blot對(duì)融合蛋白表達(dá)水平，分子量及免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析。 (6)以日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)作模板，擴(kuò)增SIEA26-28kDa天然分子候選疫苗相關(guān)編碼基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，構(gòu)建pcDNA3真核重組表達(dá)質(zhì)粒。將昆明小鼠分為生理鹽水免疫組；pcDNA3空白質(zhì)粒免疫組；pcDNA3/

9、SjRPS4重組質(zhì)粒免疫組；pcDNA3L/SjRPL7重組質(zhì)粒免疫組。分別用空白質(zhì)粒、重組質(zhì)粒、生理鹽水免疫小鼠，免疫完畢，日本血吸蟲(chóng)尾蚴攻擊感染小鼠，用減蟲(chóng)率，每克肝、腸減卵率及每雌子宮內(nèi)減卵率，對(duì)目的基因動(dòng)物免疫保護(hù)性效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 研究結(jié)果： (1)構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng)未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原單鏈抗體庫(kù)，庫(kù)容為2.27×107，從隨機(jī)挑選的克隆中均能擴(kuò)增出大小約780bp的單鏈抗體片段；而且BstNI酶切圖譜呈多樣性。

10、 (2)通過(guò)集落挖掘法篩選SIEA單鏈抗體庫(kù)，獲得了針對(duì)SIEA26-28kDa的特異性單鏈抗體，該特異性單鏈抗體分子量約為32kDa，但可溶性表達(dá)量較低。識(shí)別SIEA于26-28kDa的位置，條帶單一且明顯。 (3)通過(guò)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定，證實(shí)原核重組表達(dá)質(zhì)粒PET32a/scFv和PET32a/EGFP-scFv構(gòu)建成功?？扇苄訲rx-scFv和Trx-EGFP-scFv融合蛋白在大腸桿菌中均獲高效表達(dá)。而且融合

11、蛋白分子量與理論預(yù)期值完全一致，同時(shí)還保存了與SIEA26-28kDa天然分子的結(jié)合活性及特異性。EGFP標(biāo)記SIEA26-28kDa單鏈抗體免疫熒光定位結(jié)果顯示：熒光主要集中于未成熟蟲(chóng)卵卵胚、雌蟲(chóng)生殖系統(tǒng)及與生殖系統(tǒng)鄰近的腸腔組織，而在雄蟲(chóng)的腸壁僅見(jiàn)微弱熒光。 (4)以SIEA26-28kDa單鏈抗體為探針篩選日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)，獲得兩個(gè)編碼SIEA26-28kDa疫苗候選分子的基因：日本血吸蟲(chóng)核糖體蛋白S4(SjRP

12、S4)和日本血吸蟲(chóng)核糖體蛋白L7(SjRPL7)。 (5)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒pQE30/SjRPS4，pQE30/SjRPL7構(gòu)建成功。SDS-PAGE和Westem blot分析顯示，重組融合蛋白分子量大小與預(yù)期完全一致，并且得到了高效表達(dá)，能被特異性SIEA26-28kDa單鏈抗體、日本血吸蟲(chóng)感染鼠血清識(shí)別。不能被正常鼠血清識(shí)別。 (6)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒pcDNA3/SjRPS4

13、，pcDNA3/SjRPL7構(gòu)建成功。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，pcDNA3/SjRPS4，pcDNA3/SjRPL7真核重組質(zhì)粒免疫組減蟲(chóng)率、減卵率均明顯高于對(duì)照組，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： (1)高質(zhì)量的SIEA單鏈抗體庫(kù)得以成功構(gòu)建，其庫(kù)容量大、重組率高、多樣性好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疫苗候選分子特異性單鏈抗體的高通量篩選。 (2)應(yīng)用集落挖掘法篩選SIEA單鏈抗體庫(kù)，快速獲得了針對(duì)SIEA26-28kDa天然分子

14、候選疫苗的特異性單鏈抗體。 (3)SIEA26-28kDa單鏈抗體具有與完整SIEA26-28kDa抗體相同的特異性、結(jié)合力及靶向性，且易于通過(guò)基因工程實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)，可完全代替完整的SIEA26-28kDa抗體，用于下一步研究。 (4)特異性SIEA26-28kDa單鏈抗體作為探針，篩選日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)，獲得了天然分子候選疫苗SIEA26-28kDa相應(yīng)的兩個(gè)編碼基因SjRPS4和SjRPL7。 (5