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文檔簡介
1、DNA疫苗是一種很有希望的新型疫苗策略。如何大幅度提高DNA疫苗的免疫原性是其發(fā)展所面臨的首要問題,如何把質(zhì)粒DNA高效率導入宿主細胞以及如何實現(xiàn)抗原蛋白的高效率呈遞是DNA疫苗的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 首先,本論文應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強DNA疫苗的遞送效率。我們構(gòu)建了熒光素酶(Luciferase)表達質(zhì)粒p1.0-luc,將其通過直接肌肉注射、肌注后以雙針電極進行電穿孔、肌注后以鉗式電極進行電穿孔等三種不同方法注射小鼠,72小時后取
2、注射部位的肌肉測定Luciferase的表達情況。同時構(gòu)建攜帶密碼子優(yōu)化的HIV-1B'/C重組亞型CN54株gag基因的DNA疫苗質(zhì)粒p1.0-gag,在10μg、100μg兩個劑量水平上通過以上三種不同的方法免疫Balb/c雌性小鼠,EUSA方法檢測Gag特異的抗體反應(yīng),ELISPOT方法和細胞內(nèi)因子染色技術(shù)檢測細胞免疫應(yīng)答。結(jié)果表明應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)可以使Luciferase在小鼠肌肉中的表達水平顯著提高(最高達到66倍),并增強
3、了Gag特異的體液免疫應(yīng)答(最高達到28倍),顯示了體內(nèi)電穿孔技術(shù)在DNA疫苗遞送方面的良好作用,其中使用雙針電極的效果要顯著好于鉗式電極。同時,研究表明體內(nèi)電穿孔對于Gag特異的細胞免疫應(yīng)答并沒有顯著影響。 其次,本論文創(chuàng)造性地構(gòu)建了能夠在抗原表達細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)分子的新型DNA疫苗載體,探索dsRNA分子對DNA疫苗的佐劑效果。我們構(gòu)建了一雙表達盒的DNA質(zhì)粒pDRVI3.1,并克隆入3個含回文結(jié)構(gòu)的D
4、NA片段(包括正義鏈-莖環(huán)序列-反義鏈),獲得質(zhì)粒pDS40、pDS200及pDS750,通過在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄,可分別形成長度為40bp、200bp和750bp的dsRNA分子(含9nt或12nt的環(huán))。我們利用上述載體分別構(gòu)建了攜帶luciferase基因、HIV-1env基因、HIV-1 nef基因的重組質(zhì)粒。體內(nèi)外基因表達和細胞凋亡檢測結(jié)果表明,長的750bp dsRNA分子能夠顯著抑制外源基因表達并誘導細胞的凋亡。小鼠免疫結(jié)果表明
5、,在相同的免疫劑量和免疫次數(shù)下,攜帶短的40bp dsRNA:表達盒的DNA疫苗所誘導的特異性細胞免疫反應(yīng)顯著高于傳統(tǒng)DNA疫苗所誘導的反應(yīng)水平(最高達到4倍);在低1個數(shù)量級的質(zhì)粒劑量或少1次免疫注射的情況下,攜帶短的40bp dsRNA表達盒的DNA疫苗能夠誘導出與傳統(tǒng)DNA疫苗相同水平的細胞免疫應(yīng)答;而攜帶750bp dsRNA表達盒的質(zhì)粒不能增強細胞免疫應(yīng)答。同時,dsRNA表達盒在誘導體液免疫應(yīng)答方面不具備優(yōu)勢,甚至降低了體液
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