IFN-γ處理對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制移植物抗宿主病影響的研究.pdf

1、一、磁珠陰性分選小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　目的：用貼壁培養(yǎng)與免疫磁珠陰性分選相結(jié)合的方法對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離純化擴(kuò)增，并對擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定觀察。
　　方法：采集小鼠骨髓細(xì)胞接種貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞聚合度達(dá)90％時(shí)消化并收集該貼壁細(xì)胞，經(jīng)結(jié)合 CD11b、CD34、CD45的免疫磁珠陰性分選后的所得細(xì)胞傳代、培養(yǎng)。將免疫磁珠陰性分選前、磁珠陰性分選后培養(yǎng)至3代及未經(jīng)磁珠陰性分選培養(yǎng)至3代的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行增殖動(dòng)力學(xué)比

2、較、免疫表型測定、細(xì)胞周期測定并比較，進(jìn)行成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：3-8代培養(yǎng)基培養(yǎng)的經(jīng)MACS陰性分選培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞平均傳代倍增（6.31±0.92）倍，未經(jīng)MACS陰性分選培養(yǎng)的貼壁平均傳代倍增（2.75±0.81）倍（P<0.05）。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，免疫磁珠分選小鼠骨髓貼壁干細(xì)胞過程中磁珠分離前CDl1b+、CD34+、CD45+細(xì)胞分別與單次磁珠分離后、重復(fù)磁珠分離后比較均有顯著差異。MACS陰性分選

3、培養(yǎng)的P0代細(xì)胞與分選前收集的貼壁細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞比例有顯著差異（P＜0.05）；MACS陰性分選培養(yǎng)的P3代細(xì)胞與未行MACS陰性分選傳代培養(yǎng)的P3代貼壁細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞比例有顯著差異（P＜0.05）。經(jīng)MACS陰性分選培養(yǎng)的P3代小鼠貼壁細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2周后油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)大小不一的紅色脂泡；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后出現(xiàn)方形或多角形細(xì)胞以及鈣化結(jié)節(jié)，培養(yǎng)20天后von Kossa法染色可見有棕黑色的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽

4、沉積。
　　結(jié)論：貼壁培養(yǎng)與免疫磁珠陰性分離相結(jié)合的方法可提高小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的純度。
　　二、IFN-γ處理對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制移植物抗宿主病的影響
　　目的：觀察IFN-γ處理對間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)抑制移植物抗宿主病作用的影響。
　　方法：C57BL/6小鼠作供者，BALB/c小鼠作受者，給予受者8.0 Gy一次性全身照射后行骨髓細(xì)胞+脾細(xì)胞移植，建立完全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD動(dòng)物模型，

5、并將與IFN-γ共培養(yǎng)24h的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植后4h輸注入小鼠體內(nèi)，觀察與造血干細(xì)胞移植組、造血干細(xì)胞移植+間充質(zhì)干細(xì)胞組小鼠的飲食、毛發(fā)、精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、體位改變、靈敏度、大便等存活情況，同時(shí)監(jiān)測并對比各組小鼠體重、白細(xì)胞值、GVHD評分及組織病理改變、GVHD死亡率、存活率。
　　結(jié)果：IFN-γ處理過的間充質(zhì)干細(xì)胞輸注組于異基因造血干細(xì)胞移植后42-45d有4只小鼠死亡，體重改變較其余組偏低，白細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯偏