抑癌基因單核苷酸多態(tài)性與中國人群肝癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、腫瘤是全球范圍內(nèi)廣泛存在的發(fā)病率、死亡率均較高的疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。腫瘤屬于典型的多基因疾病(復(fù)雜疾病)，是致病因素和機(jī)體之間在長期進(jìn)化過程中交互作用的結(jié)果。不同人群或個(gè)體對(duì)腫瘤易感性的差異及其疾病進(jìn)展的差異，可能是由幾個(gè)主效基因和/或多個(gè)微效基因的累積效應(yīng)聯(lián)合致病因素的作用所致，而機(jī)體的遺傳因素在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，肝癌

2、)是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，2005年，全球共有667，000例新發(fā)病例，其死亡率居第二位，五年生存率僅為8.9％。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多途徑、多階段的復(fù)雜演變過程，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。HBV感染是導(dǎo)致肝癌的首要原因，而只有20％的慢性乙型肝炎(CHB)患者最終發(fā)展成為肝癌，提示機(jī)體的遺傳易感性和其他風(fēng)險(xiǎn)因素在肝癌的病因?qū)W中發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)研究表明，肝癌主要的危險(xiǎn)因素包括慢性肝炎病毒感染(HBV和HCV)、

3、食物中黃曲霉毒素AFB1攝入、長期過量飲酒、遺傳性肝病、肝硬化等。由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變引起的原癌基因激活和抑癌基因失活，是肝癌發(fā)生的核心生物學(xué)過程。因此，鑒定與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，將有助于揭示肝癌發(fā)生的分子機(jī)制。抑癌基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究，將為實(shí)現(xiàn)肝癌患者的個(gè)體化治療、肝癌的高危人群篩選和一級(jí)預(yù)防作出貢獻(xiàn)；也將為肝癌的早期診斷、基因靶

4、向治療、臨床監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本課題包括兩部分內(nèi)容:第一，基于中國人群參考樣本和SNP發(fā)掘技術(shù)平臺(tái)PCR-Resequencing，建立候選抑癌基因的SNP系統(tǒng)目錄:基于連鎖不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)模式和單體型(Haplotype)結(jié)構(gòu)，建立SNP數(shù)據(jù)的遺傳分析方法；第二，基于醫(yī)院的病例-對(duì)照研究，分析候選抑癌基因SNP與中國人群肝癌易感性的相關(guān)性。首先，建立了三個(gè)抑癌

5、基因SOCS-1，TOB-1，CST6在中國人群的SNP系統(tǒng)目錄，共發(fā)掘了16個(gè)SNP；而后解析其LD模式和單體型結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)的重組使LD模式很不規(guī)則，但均可解析出單體型多態(tài)性較低的少數(shù)LD模塊，說明LD和單體型分析可為遺傳關(guān)聯(lián)研究的標(biāo)記選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供重要信息，通過SNP發(fā)掘和多態(tài)性數(shù)據(jù)遺傳分析的平臺(tái)，為后續(xù)研究奠定了實(shí)驗(yàn)材料和方法學(xué)的基礎(chǔ)。而后，選擇了與肝癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)理密切相關(guān)的三個(gè)抑癌基因PTEN、DLC-1，LPTS/P

6、inX1為候選易感基因，研究PTENIVS4+109ins5；DLC-1C46802T、A32464C、G33014A；LPTS/PinXlIVS6G+102C、IVS2+18C/T多態(tài)性與肝癌遺傳易感性的相關(guān)性。通過病例-對(duì)照研究，采用PCR-RFLP或DNA直接測(cè)序方法對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行分型。入選的434例肝癌病例和480個(gè)對(duì)照樣本采自我國南方肝癌高發(fā)地區(qū)之一--廣西壯族自治區(qū)扶綏縣及其周邊地區(qū)。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

7、。
　　 經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別等混雜因素后，PTENIVS4+109ins5等位型的頻率和基因型的分布在病例組和對(duì)照組之間存在顯著性差異，在總體樣本，與攜帶至少一個(gè)插入型等位(I/D+I/I)的個(gè)體相比，攜帶缺失型純合子D/D的個(gè)體患肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加1.9倍(OR=1.90；95％CI，1.32-2.73；p=0.001)；按照乙肝病毒攜帶狀態(tài)、性別、民族、吸煙、飲酒、家族史等分層分析，上述關(guān)聯(lián)仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D

8、/D基因型與飲酒有交互作用，協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)5.7倍(OR=5.69；95％CI，3.36-9.64；p<0.001)；經(jīng)過分層分析，交互作用仍然存在。D/D基因型與家族史有交互作用，協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)82.7倍(OR=82.7；95％Cl，10.3-663.2；p<0.001)。提示PTENIVS4+109ins5多態(tài)性與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，缺失型D/D是風(fēng)險(xiǎn)基因型，從遺傳學(xué)角度證明肝癌是遺傳與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。此關(guān)聯(lián)結(jié)果具有很強(qiáng)的

9、生物學(xué)依據(jù)。抑癌基因PTEN編碼雙特異性磷酸脂酶，通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。PTEN在多種進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)生突變與缺失，導(dǎo)致其編碼蛋白的抑癌功能減弱或喪失，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。D/D基因型代表PTEN基因外顯子1-5的缺失，而外顯子5編碼PTEN發(fā)揮抑癌功能的核心結(jié)構(gòu)域--磷酸酶活性中心，表明攜帶D/D基因型的個(gè)體PTEN蛋白喪失了部分抑癌功能，因而無法抑制

10、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　 經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別等因素，DLC-1多態(tài)性C46802T、G33014A與肝癌的遺傳易感性相關(guān)。C46802T的基因型和等位型分布在病例和對(duì)照之間有顯著性差異，在總體樣本，與攜帶至少一個(gè)T等位型(C/T+T/T)的個(gè)體相比，攜帶純合子C/C的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加2.1倍(OR=2.07；95％CI，1.41-3.04；p<0.001)；按照乙肝病毒攜帶狀態(tài)、性別、民族、吸煙、飲酒、家族

11、史分層分析，上述關(guān)聯(lián)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C/C基因型與飲酒有交互作用，協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)7.3倍(OR=7.26；95％CI，3.31-15.90；p<0.001)；分層分析，交互作用仍然存在。C/C基因型與家族史有交互作用，二者協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)約20倍(OR=19.9；95％CI，6.6-59.8；p<0.001)。C33014T位點(diǎn)在總體樣本中，基因型和等位型頻率在病例和對(duì)照之間無顯著性差異；但分層分析，在非飲酒者、壯族、有家族史的個(gè)體中

12、，基因型和等位型的分布有顯著性差異。A32464C位點(diǎn)在總體樣本及分層分析后，基因型和等位型的分布均無顯著性差異，說明A32464C單獨(dú)地與肝癌易感性無關(guān)。以DLC-1三個(gè)位點(diǎn)A32464C、C33014T、C46802T構(gòu)建單體型，分析單體型多樣性與肝癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，與攜帶htp8[CTT]的個(gè)體相比，攜帶htpl[ACC]單體型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)增加3.3倍(OR=3.30；95％CI，1.76-4.21；p=0.005)；與非攜帶h

13、tpl[ACC]的個(gè)體相比，攜帶至少一個(gè)htpl[ACC]單體型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍(OR=1.55；95％CI，1.13-2.13；p=0.007)，表明htpl[ACC]是風(fēng)險(xiǎn)單體型，而htp8[CTT]是保護(hù)性單體型。
　　 經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別等因素后，在總體樣本，LPTSIVS6G+102C多態(tài)性的基因型和等位型分布在病例和對(duì)照之間無顯著性差異；但分層分析，在壯族，有家族史者，乙肝病毒攜帶者中的吸

14、煙者、飲酒者和男性個(gè)體中，病例和對(duì)照之間基因型和等位型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。G/G基因型與飲酒有交互作用，協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)5.44倍；G/G基因型與家族史有交互作用，協(xié)同增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)5.69倍。IVS2+18C/T位點(diǎn)的等位型及基因型分布在總體樣本中無差異；分層分析，在乙肝病毒攜帶者、非攜帶者和壯族人群中，與C/C相比，攜帶G/G基因型的個(gè)體患肝癌風(fēng)險(xiǎn)分別增加1.9倍(OR=1.90；95％CI，1.01-3.58；p=0.047)、3.4

15、倍(OR=3.43；95％CI，1.05-11.24；p=0.042)和2.2倍(OR=2.17；95％CI，1.04-4.54；p=0.039)。
　　 基因-基因交互作用分析顯示，PTENIVS4+109ins5與DLC1C46802C協(xié)同增加患肝癌風(fēng)險(xiǎn)3.6倍(OR=3.59；95％CI，1.37-8.22；p=0.008)?；?環(huán)境交互作用，PTENIVS4+109ins5D/D、DLC1C46802C與飲酒協(xié)同增加患

16、肝癌風(fēng)險(xiǎn)10.2倍(OR=10.16；95％CI，1.81-57.12；p＝0.008)。PTEN和DLC1是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中極其重要的抑癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等。PTENIVS4+109ins5緊鄰?fù)怙@子5這一突變熱點(diǎn)，D/D代表PTEN喪失其抑癌功能；DLC1C46802T位于內(nèi)含子13，可能導(dǎo)致mRNA選擇性剪切，影響DLC1的抑癌功能。推測(cè)同時(shí)攜帶PTENIVS4+10

17、9ins5D/D、DLC1C46802C基因型的個(gè)體，其編碼抑癌蛋白的功能部分喪失，因此更易發(fā)生肝癌。本研究表明，PTENIVS4+109ins5、DLC-1C46802T和G33014A、LPTSIVS6G+102C多態(tài)性與中國人群肝癌遺傳易感性相關(guān)，首次在群體水平證實(shí)了這些抑癌基因在肝癌病因?qū)W中的作用。
　　 我們建立了三個(gè)重要抑癌基因SOCS-1，TOB-1，CST6在中國人群的SNP系統(tǒng)目錄，共發(fā)掘了16個(gè)SNP；而后解