抑癌基因單核苷酸多態(tài)性與中國人群肝癌遺傳易感性關聯研究.pdf

1、腫瘤是全球范圍內廣泛存在的發(fā)病率、死亡率均較高的疾病之一，嚴重威脅著人類健康。腫瘤屬于典型的多基因疾病(復雜疾病)，是致病因素和機體之間在長期進化過程中交互作用的結果。不同人群或個體對腫瘤易感性的差異及其疾病進展的差異，可能是由幾個主效基因和/或多個微效基因的累積效應聯合致病因素的作用所致，而機體的遺傳因素在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，肝癌

2、)是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，2005年，全球共有667，000例新發(fā)病例，其死亡率居第二位，五年生存率僅為8.9％。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多途徑、多階段的復雜演變過程，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結果。HBV感染是導致肝癌的首要原因，而只有20％的慢性乙型肝炎(CHB)患者最終發(fā)展成為肝癌，提示機體的遺傳易感性和其他風險因素在肝癌的病因學中發(fā)揮重要作用。流行病學研究表明，肝癌主要的危險因素包括慢性肝炎病毒感染(HBV和HCV)、

3、食物中黃曲霉毒素AFB1攝入、長期過量飲酒、遺傳性肝病、肝硬化等。由遺傳學和表觀遺傳學改變引起的原癌基因激活和抑癌基因失活，是肝癌發(fā)生的核心生物學過程。因此，鑒定與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關的基因，將有助于揭示肝癌發(fā)生的分子機制。抑癌基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與肝癌遺傳易感性的關聯研究，將為實現肝癌患者的個體化治療、肝癌的高危人群篩選和一級預防作出貢獻；也將為肝癌的早期診斷、基因靶

4、向治療、臨床監(jiān)測、預后判斷等奠定理論和實驗基礎。
　　 本課題包括兩部分內容:第一，基于中國人群參考樣本和SNP發(fā)掘技術平臺PCR-Resequencing，建立候選抑癌基因的SNP系統目錄:基于連鎖不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)模式和單體型(Haplotype)結構，建立SNP數據的遺傳分析方法；第二，基于醫(yī)院的病例-對照研究，分析候選抑癌基因SNP與中國人群肝癌易感性的相關性。首先，建立了三個抑癌

5、基因SOCS-1，TOB-1，CST6在中國人群的SNP系統目錄，共發(fā)掘了16個SNP；而后解析其LD模式和單體型結構，發(fā)現基因內的重組使LD模式很不規(guī)則，但均可解析出單體型多態(tài)性較低的少數LD模塊，說明LD和單體型分析可為遺傳關聯研究的標記選擇和實驗設計提供重要信息，通過SNP發(fā)掘和多態(tài)性數據遺傳分析的平臺，為后續(xù)研究奠定了實驗材料和方法學的基礎。而后，選擇了與肝癌發(fā)生、發(fā)展機理密切相關的三個抑癌基因PTEN、DLC-1，LPTS/P

6、inX1為候選易感基因，研究PTENIVS4+109ins5；DLC-1C46802T、A32464C、G33014A；LPTS/PinXlIVS6G+102C、IVS2+18C/T多態(tài)性與肝癌遺傳易感性的相關性。通過病例-對照研究，采用PCR-RFLP或DNA直接測序方法對上述位點進行分型。入選的434例肝癌病例和480個對照樣本采自我國南方肝癌高發(fā)地區(qū)之一--廣西壯族自治區(qū)扶綏縣及其周邊地區(qū)。采用SPSS11.5統計軟件進行數據分析

7、。
　　 經Logistic回歸校正年齡、性別等混雜因素后，PTENIVS4+109ins5等位型的頻率和基因型的分布在病例組和對照組之間存在顯著性差異，在總體樣本，與攜帶至少一個插入型等位(I/D+I/I)的個體相比，攜帶缺失型純合子D/D的個體患肝癌風險增加1.9倍(OR=1.90；95％CI，1.32-2.73；p=0.001)；按照乙肝病毒攜帶狀態(tài)、性別、民族、吸煙、飲酒、家族史等分層分析，上述關聯仍然具有統計學意義；D

8、/D基因型與飲酒有交互作用，協同增加肝癌風險5.7倍(OR=5.69；95％CI，3.36-9.64；p<0.001)；經過分層分析，交互作用仍然存在。D/D基因型與家族史有交互作用，協同增加肝癌風險82.7倍(OR=82.7；95％Cl，10.3-663.2；p<0.001)。提示PTENIVS4+109ins5多態(tài)性與肝癌發(fā)生風險相關，缺失型D/D是風險基因型，從遺傳學角度證明肝癌是遺傳與環(huán)境因素相互作用的結果。此關聯結果具有很強的

9、生物學依據。抑癌基因PTEN編碼雙特異性磷酸脂酶，通過復雜的信號轉導網絡來調控細胞周期、促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤侵襲和轉移等。PTEN在多種進展期、轉移性腫瘤中發(fā)生突變與缺失，導致其編碼蛋白的抑癌功能減弱或喪失，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。D/D基因型代表PTEN基因外顯子1-5的缺失，而外顯子5編碼PTEN發(fā)揮抑癌功能的核心結構域--磷酸酶活性中心，表明攜帶D/D基因型的個體PTEN蛋白喪失了部分抑癌功能，因而無法抑制

10、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　 經Logistic回歸校正年齡、性別等因素，DLC-1多態(tài)性C46802T、G33014A與肝癌的遺傳易感性相關。C46802T的基因型和等位型分布在病例和對照之間有顯著性差異，在總體樣本，與攜帶至少一個T等位型(C/T+T/T)的個體相比，攜帶純合子C/C的個體患肝癌的風險增加2.1倍(OR=2.07；95％CI，1.41-3.04；p<0.001)；按照乙肝病毒攜帶狀態(tài)、性別、民族、吸煙、飲酒、家族

11、史分層分析，上述關聯仍有統計學意義；C/C基因型與飲酒有交互作用，協同增加肝癌風險7.3倍(OR=7.26；95％CI，3.31-15.90；p<0.001)；分層分析，交互作用仍然存在。C/C基因型與家族史有交互作用，二者協同增加肝癌風險約20倍(OR=19.9；95％CI，6.6-59.8；p<0.001)。C33014T位點在總體樣本中，基因型和等位型頻率在病例和對照之間無顯著性差異；但分層分析，在非飲酒者、壯族、有家族史的個體中

12、，基因型和等位型的分布有顯著性差異。A32464C位點在總體樣本及分層分析后，基因型和等位型的分布均無顯著性差異，說明A32464C單獨地與肝癌易感性無關。以DLC-1三個位點A32464C、C33014T、C46802T構建單體型，分析單體型多樣性與肝癌風險的關聯發(fā)現，與攜帶htp8[CTT]的個體相比，攜帶htpl[ACC]單體型的個體患病風險增加3.3倍(OR=3.30；95％CI，1.76-4.21；p=0.005)；與非攜帶h

13、tpl[ACC]的個體相比，攜帶至少一個htpl[ACC]單體型的個體患病風險增加1.6倍(OR=1.55；95％CI，1.13-2.13；p=0.007)，表明htpl[ACC]是風險單體型，而htp8[CTT]是保護性單體型。
　　 經Logistic回歸校正年齡、性別等因素后，在總體樣本，LPTSIVS6G+102C多態(tài)性的基因型和等位型分布在病例和對照之間無顯著性差異；但分層分析，在壯族，有家族史者，乙肝病毒攜帶者中的吸

14、煙者、飲酒者和男性個體中，病例和對照之間基因型和等位型分布有統計學差異。G/G基因型與飲酒有交互作用，協同增加肝癌風險5.44倍；G/G基因型與家族史有交互作用，協同增加肝癌風險5.69倍。IVS2+18C/T位點的等位型及基因型分布在總體樣本中無差異；分層分析，在乙肝病毒攜帶者、非攜帶者和壯族人群中，與C/C相比，攜帶G/G基因型的個體患肝癌風險分別增加1.9倍(OR=1.90；95％CI，1.01-3.58；p=0.047)、3.4

15、倍(OR=3.43；95％CI，1.05-11.24；p=0.042)和2.2倍(OR=2.17；95％CI，1.04-4.54；p=0.039)。
　　 基因-基因交互作用分析顯示，PTENIVS4+109ins5與DLC1C46802C協同增加患肝癌風險3.6倍(OR=3.59；95％CI，1.37-8.22；p=0.008)。基因-環(huán)境交互作用，PTENIVS4+109ins5D/D、DLC1C46802C與飲酒協同增加患

16、肝癌風險10.2倍(OR=10.16；95％CI，1.81-57.12；p＝0.008)。PTEN和DLC1是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中極其重要的抑癌基因，參與調控細胞周期、促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤的侵襲和轉移等。PTENIVS4+109ins5緊鄰外顯子5這一突變熱點，D/D代表PTEN喪失其抑癌功能；DLC1C46802T位于內含子13，可能導致mRNA選擇性剪切，影響DLC1的抑癌功能。推測同時攜帶PTENIVS4+10

17、9ins5D/D、DLC1C46802C基因型的個體，其編碼抑癌蛋白的功能部分喪失，因此更易發(fā)生肝癌。本研究表明，PTENIVS4+109ins5、DLC-1C46802T和G33014A、LPTSIVS6G+102C多態(tài)性與中國人群肝癌遺傳易感性相關，首次在群體水平證實了這些抑癌基因在肝癌病因學中的作用。
　　 我們建立了三個重要抑癌基因SOCS-1，TOB-1，CST6在中國人群的SNP系統目錄，共發(fā)掘了16個SNP；而后解