重組腺相關(guān)病毒-LIGHT對(duì)小鼠宮頸癌模型的治療作用研究.pdf

1、第一部分、重組腺相關(guān)病毒-LIGHT 對(duì)小鼠宮頸癌模型的治療作用研究
　　 目的：構(gòu)建含腫瘤壞死因子超家族成員14（LIGHT）的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-LIGHT)，探討(rAAV-LIGHT)對(duì)TC-1細(xì)胞株所建立的小鼠宮頸癌模型的抑瘤效應(yīng)的可行性。
　　 方法：用基因重組方法構(gòu)建含LIGHT全長(zhǎng)的重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP，磷酸鈣沉淀法將腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入病毒包裝細(xì)胞

2、中，分別合成rAAV-LIGHT和rAAV-GFP。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)病毒滴度。RTPCR檢測(cè)rAAV-LIGHT對(duì)TC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。體外用淋巴毒性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)LIGHT的免疫效應(yīng)。小鼠細(xì)胞系TC-1（轉(zhuǎn)染過(guò)E6E7RAS）用于建立小鼠宮頸癌模型。成瘤第3天對(duì)空白對(duì)照組（5只小鼠），rAAV-GFP(5 只小鼠)，rAAV-LIGHT(5 只小鼠)組分別進(jìn)行肌肉注射。觀察其生物特性及用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中LIGHT和

3、其他細(xì)胞因子的表達(dá)情況。觀察rAAV-LIGHT的抑瘤效應(yīng)。通過(guò)流式細(xì)胞儀和腫瘤組織H&E染色、免疫組化檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞增值效應(yīng)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建并鑒定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP，滴度為2.5×1010 v.g/ml,轉(zhuǎn)染效率為60％。SPSS13.0分析結(jié)果顯示rAAVLIGHT組腫瘤大小明顯小于對(duì)照組及rAAV-GFP組(P=0.0055,P=0.029 P＜0.05)。對(duì)照組及rAAV-GFP組比較無(wú)明

4、顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.115 P＞0.05)。
　　 結(jié)論：rAAV-LIGHT可在小鼠宮頸癌模型逆轉(zhuǎn)腫瘤生長(zhǎng)。
　　 第二部分、攜帶小鼠HVEM的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：克隆小鼠皰疹病毒侵入介體（HVEM）基因，構(gòu)建其重組腺相關(guān)病毒載體，鑒定目的基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，為免疫基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：用RT-PCR法從小鼠脾臟淋巴細(xì)胞克隆出全長(zhǎng)HVEM基因，構(gòu)建攜帶HVEM基因的

5、穿梭質(zhì)粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和輔助質(zhì)粒pAAV-RC，pHelper利用磷酸鈣共沉淀法將穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入AAV-293細(xì)胞中，采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒rAAV-HVEM。用氯仿-PEG8000法純化病毒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)病毒滴度。RT-PCR檢測(cè)rAAV-HVEM在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建組裝重組小鼠HVEM腺相關(guān)病毒，純化后病毒滴度為5×10