淫羊藿素對人骨肉瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:骨肉瘤是骨的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年。據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性骨腫瘤中，其發(fā)病率僅次于漿細(xì)胞骨髓瘤居第2位。骨肉瘤惡性程度高，較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。現(xiàn)階段治療方法主要包括手術(shù)、化療、放射治療及綜合療法，近年來骨肉瘤截肢率明顯降低，很大程度歸功于以化療為主的綜合治療技術(shù)的進(jìn)步，繼續(xù)探索全新有效的化療藥物對骨肉瘤的治療意義重大。
　　 淫羊藿為祖國傳統(tǒng)中草藥，性溫，味辛，兼具補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，其有效

2、成分為黃酮類化合物，此外尚含有多糖類化合物等。淫羊藿能改善心肌缺血、降血壓、調(diào)節(jié)免疫、抑制血栓形成、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗衰老等作用。從淫羊藿中提取的黃酮單體成份，為淫羊藿苷，具有多種生物活性，包括改善心血管功能、抗腫瘤、影響內(nèi)分泌、抑制血小板聚集、抗衰老及調(diào)節(jié)免疫功能等。淫羊藿素(Icaritin，ICT)作為淫羊藿苷的衍生物，系淫羊藿經(jīng)多重步驟的萃取、硅膠層析、洗脫后制得，具有抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和增殖、治療心血管

3、疾病、保護(hù)神經(jīng)變性損傷、防治乳腺癌等作用。淫羊藿素的分子式為C21H20O6，分子量368，淫羊藿素與其前體物質(zhì)淫羊藿苷具有極其相似的分子結(jié)構(gòu)，但淫羊藿素酮環(huán)母體的兩個羥基取代了淫羊藿苷中的糖苷元，從藥物構(gòu)效關(guān)系的角度推測其抗氧化功能將進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　 淫羊藿素相關(guān)研究提示，其抗腫瘤作用已日益引起人們的重視，成為近年來研究的熱點(diǎn)。淫羊藿素對于多種腫瘤細(xì)胞株，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌和慢粒等，皆有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的

4、作用。但至今，淫羊藿素作用于骨肉瘤細(xì)胞的上述方面的研究還沒有相關(guān)報道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過研究淫羊藿素對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖、凋亡的影響，探討其對骨肉瘤細(xì)胞的作用，為臨床上骨肉瘤的治療提供新的理論與方法。
　　 目的:觀察淫羊藿素對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討淫羊藿素對人骨肉瘤細(xì)胞的作用。
　　 方法:藥物作用細(xì)胞后，使用倒置顯微鏡，觀察MG-63細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;四甲基偶氮唑鹽(M

5、TT)比色法檢測MG-63細(xì)胞的增殖;Annexin V/PI雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡;Caspase活性定量檢測試劑盒檢測半胱天冬特異性蛋白酶-9，8，3(Caspase-9，8，3)的活性。
　　 結(jié)果:1.倒置顯微鏡觀察淫羊藿素處理后的MG-63細(xì)胞，顯示隨藥物濃度的增加或藥物作用時間的延長，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞數(shù)量降低，細(xì)胞逐漸縮小、失去貼壁能力而浮起、折光度降低、細(xì)胞分布松散。
　　 2.MTT比色法

6、檢測不同濃度的淫羊藿素作用于MG-63細(xì)胞，藥物濃度為4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L時，藥物濃度越高，淫羊藿素對細(xì)胞的抑制率越高，作用時間越長，對細(xì)胞的抑制作用越顯著(P＜0.05)。當(dāng)淫羊藿素濃度為64μmol/L時，其抑制率較32μmol/L濃度組無明顯的增加，其對細(xì)胞增殖抑制的效果無明顯的加強(qiáng)(P＞0.05)。可見淫羊藿素對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖的抑制存在時間和濃度相關(guān)性。
　　 3

7、.流式細(xì)胞儀分析:4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的淫羊藿素作用24h后，其細(xì)胞凋亡率分別為(14.17±1.16)％、(22.01±3.21)％、(28.71±2.17)％、(45.75±3.24)％;作用48小時后，其細(xì)胞凋亡率分別為(24.21±2.17)％、(43.52±4.15)％、(71.57±3.26)％、(79.19±4.54)％。分析發(fā)現(xiàn)4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L

8、、32μmol/L的淫羊藿素分別作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞24、48小時，隨著藥物濃度的持續(xù)增加，其早期凋亡率和晚期凋亡率也逐漸增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在相同淫羊藿素濃度下，藥物作用48小時的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡率明顯高于作用24小時的MG-63細(xì)胞凋亡率，以4μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度組為明顯，其中16μmol/L濃度組作用效果最為顯著。可見，淫羊藿素誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡存在時間

9、和藥物濃度的相關(guān)性。其誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的藥物作用的趨勢和MTT結(jié)果大致符合。
　　 4.4μmol/L、8μmol/L的淫羊藿素作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞24小時、48小時，其Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性相對于對照組沒有明顯的增強(qiáng)(P＞0.05)，其三種酶的活性隨作用時間及藥物濃度的變化而增強(qiáng)的趨勢不明顯。16μmol/L的淫羊藿素作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞24小時，其Cas

10、pase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性相對于對照組有明顯的增強(qiáng)(P＜0.05)，在本藥物濃度下作用48小時，較24小時作用時間下酶活性沒有明顯的增強(qiáng)（P＞0.05）。32μmol/L的淫羊藿素作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞24小時，其Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性相對于對照組及16μmol/L組有明顯的增強(qiáng)(P＜0.05)，在本藥物濃度下作用48小時，較24小時作用時間下酶活性沒有明顯