LY294002對人骨肉瘤類腫瘤干細胞的影響及其作用機制.pdf

1、目的:
　　1.研究無血清培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法用于人骨肉瘤類腫瘤干細胞的分離培養(yǎng),探討兩者作為分選方法的可行性。
　　2.研究Nanog在人骨肉瘤及其類腫瘤干細胞的中的表達及意義。
　　3.研究LY294002對人骨肉瘤類腫瘤干細胞增殖和細胞周期的影響,并初步探討其抑制增殖作用可能的機制。
　　4.研究LY294002對人骨肉瘤類腫瘤干細胞凋亡的影響,并初步探討其誘導(dǎo)凋亡作用可能的機制。
　　方法:

2、>　　1.無血清培養(yǎng)法分離人骨肉瘤類腫瘤干細胞;免疫磁珠分選CD133+CD44+人骨肉瘤細胞;免疫組織化學(xué)法鑒定人骨肉瘤類腫瘤干細胞CD44和CD133的表達情況;蛋白印跡法檢測骨肉瘤及其類腫瘤干細胞Nanog的表達并進行半定量分析。
　　2.實驗分組:LY294002在培養(yǎng)基中的濃度分別為0μmol/L(對照組)、5μmol/L、15μmol/L和45μmol/L。
　　3.CCK-8法檢測人骨肉瘤類腫瘤干細胞在不同LY

3、294002濃度下的增殖情況;碘化丙啶PI染色流式細胞術(shù)檢測人骨肉瘤類腫瘤干細胞在不同LY294002濃度下細胞周期的變化;蛋白印跡法法檢測人骨肉瘤類腫瘤干細胞在不同LY294002濃度下總AKT、磷酸化AKT和β-肌動蛋白的表達情況。
　　4.AnnexinV/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測人骨肉瘤類腫瘤干細胞在不同LY294002濃度下的凋亡情況;蛋白印跡法檢測半胱天冬酶-3、活化型半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、活化型聚腺苷二磷酸

4、核糖聚合酶和β-肌動蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.采用無血清培養(yǎng)法可以從人骨肉瘤MG63細胞中分離出成“細胞球”生長的人骨肉瘤類腫瘤干細胞;采用免疫磁珠法可以從人骨肉瘤MG63細胞中分離出CD133+CD44+人骨肉瘤細胞,該細胞亦可在含表皮生長因子和成纖維生長因子的無血清培養(yǎng)基中形成“細胞球”;將上述骨肉瘤類腫瘤干細胞球傳代于無血清培養(yǎng)基仍可形成相似的人骨肉瘤類腫瘤干細胞球;人骨肉瘤類腫瘤干細胞CD44和CD133

5、均呈陽性表達;人骨肉瘤類腫瘤干細胞Nanog表達水平強于人骨肉瘤MG63細胞(P<0.05)。
　　2.與對照組相比較,無論何種濃度的LY294002均對人骨肉瘤類腫瘤干細胞的增殖有一定的抑制作用,且其抑制作用與劑量有一定的相關(guān)性;各干預(yù)組與對照組比較人骨肉瘤類腫瘤干細胞中G0/G1期的細胞比例明顯增多(P<0.01),增殖指數(shù)明顯減低(P<0.01);隨著LY294002濃度的不斷增加,人骨肉瘤類腫瘤干細胞中的pAKT表達量逐漸

6、下降。
　　3.隨著LY294002濃度的逐漸增加,各干預(yù)組活細胞有所下降,而凋亡有所增加,這種對凋亡的促進作用同樣表達出一定的劑量依賴性,其中45μmol/L組最為明顯(P<0.01);在對照組和干預(yù)組中均可以檢測到半胱天冬酶-3的表達,但是活化型半胱天冬酶-3只有在干預(yù)組中才能觀察到明顯的表達,且活化型半胱天冬酶-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的表達量隨LY294002濃度的增高也呈現(xiàn)上升趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.無

7、血清培養(yǎng)法可以用于人骨肉瘤類腫瘤干細胞的分離和培養(yǎng);Nanog作為維持細胞多能性的關(guān)鍵蛋白,可能成為分離和鑒定人骨肉瘤類腫瘤干細胞的標志之一。
　　2.LY294002對人骨肉瘤類腫瘤干細胞表現(xiàn)出對增殖的抑制作用,該作用可能是通過其抑制PI3K而導(dǎo)致其下游AKT活性減弱,細胞發(fā)生G0/G1期細胞周期阻滯所介導(dǎo)的。
　　3.LY294002對人骨肉瘤類腫瘤干細胞表現(xiàn)出對凋亡的促進作用,該作用可能是通過其抑制PI3K導(dǎo)致其下游A