荷載KGF納米微囊組織工程皮膚的構(gòu)建及其修復(fù)皮膚缺損的實驗研究.pdf

1、[目的] 構(gòu)建荷載KGF納米微囊的新型組織工程皮膚，研究其對裸鼠皮膚缺損的修復(fù)效果。 [方法] 1．荷載KGF納米微囊ADM(KGF-ADM)的構(gòu)建：采用超聲乳化一溶劑揮發(fā)及低溫干燥方法，將KGF以牛血清白蛋白(BSA)作聯(lián)接包裹在聚乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)內(nèi)形成納米微囊，并采用低溫干燥的方法將微囊交聯(lián)于脫細胞真皮(ADM)上。檢測納米微囊的釋放規(guī)律及載藥量、包圭摔等指標(biāo)，在掃描電鏡下觀察微囊形態(tài)及其與A

2、DM的交聯(lián)情況。 2．表皮干細胞的培養(yǎng)及鑒定：采用I型膠原酶復(fù)合胰蛋白酶消化方法，從健康人包皮組織取得表皮干細胞群，分別進行Hoechst 33342復(fù)合β1-整合素(integrin)-氰3(Cy3)免疫熒光鑒定，并對比培養(yǎng)基添加角質(zhì)細胞生長因子(KGF)與否對表皮細胞群生長曲線的影響，觀察其體外增殖情況。同時，用胰蛋白酶消化包皮的真皮層分離得到成纖維細胞并體外培養(yǎng)擴增。 3．細胞在荷載KGF納米微囊ADM及PLGA上

3、的生長情況：KGF-ADM經(jīng)紫外線照射消毒后，在其上接種表皮干細胞群，培養(yǎng)3天后，在掃描電鏡下觀察細胞生長情況。 4．荷載KGF納米微囊組織工程皮膚的構(gòu)建及其對裸鼠皮膚缺損的修復(fù)效果：KGF-ADM經(jīng)紫外線照射消毒后，在其上接種表皮干細胞群，體外培養(yǎng)一周后，翻轉(zhuǎn)KGF-ADM，在其反面接種同期分離的成纖維細胞，繼續(xù)培養(yǎng)一天后，移植于裸鼠背部皮膚缺損處，以裸鼠自體皮膚移植作對照，以無KGF納米微囊的組織工程皮膚為空白組，觀察在2周

4、、4周及6周時各組修復(fù)區(qū)愈合情況及皮片攣縮情況，收集各組修復(fù)區(qū)皮膚作病理切片，行H-E染色在光學(xué)顯微鏡下觀察表皮層及真皮層細胞情況，并行抗人K10-FITC及抗人β1-integrin-Cy3免疫熒光檢測，了解修復(fù)區(qū)表皮細胞分層情況及是否仍存有干細胞。 [結(jié)果]采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)及低溫干燥方法可成功制作KGF納米微囊，納米微囊成球率為85﹪，載藥量為17.3﹪，包封率為73.5﹪。納米微囊中BSA可以控制緩慢釋放，釋放初期，釋放速度

5、較快，前5日已累計釋放約40﹪，后進入緩慢釋放期，30日時累計釋放約75﹪。掃描電鏡檢測顯示：微囊球形形態(tài)良好，球體表面光滑無皺褶，在ADM表面分布均勻，與ADM連接緊密，大部分微囊均勻分布于ADM表面，有小部分分布于ADM深面。采用Ⅰ型膠原酶復(fù)合胰蛋白酶消化方法取得的表皮細胞群中，含有β1-integrin表達陽性的干細胞。表皮干細胞群在KGF-ADM表面生長情況良好，細胞形態(tài)多樣，與KGF-ADM粘貼緊密，可見到小圓形且成團分布的干

6、細胞及多角形的終末細胞，細胞形態(tài)規(guī)則，活性良好，有連接成片的趨勢，部分形成克隆團塊。以荷載KGF納米微囊組織工程皮膚修復(fù)裸鼠皮膚缺損，2周、4周及6周時修復(fù)效果均優(yōu)于對照組及空白組，移植之皮膚邊緣可與臨近皮膚完全融合，存在一定的攣縮，鏡下可見到其表皮細胞分層良好，能產(chǎn)生正常角質(zhì)層，8周及10周時實驗組切片行免疫熒光檢測可見到基底層仍存有極少數(shù)β1-integrin陽性細胞，可能為表皮干細胞或短暫擴充細胞。 [結(jié)論] 采用