基于糖尿病皮膚潰瘍局部微環(huán)境特征初步構(gòu)建組織工程皮膚的研究.pdf

1、目的：
　　 糖尿病慢性皮膚潰瘍難以愈合，嚴(yán)重危害著患者的身心健康，已成為全球公認(rèn)的一個亟需解決的難題。本研究針對糖尿病皮膚潰瘍局部酸微環(huán)境應(yīng)用天然生物高分子材料設(shè)計新型酸敏感水凝膠，并選擇神經(jīng)生長因子(nerve growthfactor，NGF)作為目的蛋白構(gòu)建含綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體以獲得穩(wěn)定表達(dá)NGF蛋白的細(xì)胞系，進(jìn)一步利用該水凝膠材料負(fù)載轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞構(gòu)筑細(xì)胞/材料三維復(fù)合物，期望實現(xiàn)響應(yīng)酸環(huán)境刺激種子細(xì)胞控制性釋

2、放生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)以促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍愈合。
　　 方法：
　　 第一部分：選擇NGF作為目的片段，從健康成年人血中提取基因組DNA，根據(jù)Ensembl所提供的ENST00000369512序列和pSELECT-GFPzeo-MCS質(zhì)粒的多克隆位點，在上下游引物中加入BamHⅠ和NheⅠ的限制性酶切位點序列，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出含前導(dǎo)肽及信號肽的β-NGF前體基因，并與克隆質(zhì)粒pGM-T構(gòu)建克隆載體pGM-T/β-

3、NGF，經(jīng)測序正確后，再將該目的片段與真核表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo-MCS連接，構(gòu)建含綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo/β-NGF，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)Zeocin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，進(jìn)一步應(yīng)用ELISA法檢測目的蛋白的表達(dá)量，并通過噻唑藍(lán)(Thiazolyl blue，MTT)法評價其生物學(xué)活性。
　　 第二部分：選擇天然生物高分子材料殼聚糖經(jīng)2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTM

4、AC)進(jìn)行季銨化改性后，與混合甘油磷酸鈉(α-β-GP)制備出新型酸敏感水凝膠，用紅外光譜(FTIR)和掃描電子顯微鏡(SEM)對其進(jìn)行表征，并對水凝膠的溶脹度、體外釋放蛋白性能及細(xì)胞毒性進(jìn)行評價；并以水凝膠材料作為支架負(fù)載轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞構(gòu)筑細(xì)胞/材料三維復(fù)合物，通過掃描電子顯微鏡觀察其超微觀結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳顯示為一長約726 bp的清晰條帶；
　　 2.將產(chǎn)物純

5、化后與pGM-T克隆載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選所得的陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NheⅠ的雙酶切可得到約726 bp的條帶，經(jīng)測序證實與Ensembl所提供的序列完全相符；
　　 3.將BamHⅠ和NheⅠ雙酶切所得NGF基因和表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo-MCS進(jìn)行連接，經(jīng)Zeocin抗生素篩選出的陽性質(zhì)粒，再經(jīng)BamHⅠ和NheⅠ雙酶切后再次得到約726 bp的條帶，測序證實與Ensembl中的序列完全相同；
　　

6、 4.轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)Zeocin抗生素篩選8周后成功獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，綠色熒光蛋白持續(xù)表達(dá)；
　　 5.ELISA法檢測目的蛋白的表達(dá)量為21.78 ng/24 h/106 cells，MTT法檢測其對NIH3T3細(xì)胞生長具有明顯的促增殖的作用，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；
　　 6.HTCC/GP水凝膠溶脹度良好，能響應(yīng)pH變化控制釋放蛋白，MTT法檢測該水凝膠不影響細(xì)胞增殖，對細(xì)胞沒有毒性，

7、組間存在差異(p<0.05)；將該水凝膠負(fù)載轉(zhuǎn)基因CHO-K1細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞/材料三維復(fù)合物，掃描電鏡顯示其成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑比較均一，細(xì)胞黏附良好。
　　 結(jié)論：
　　 1.首次成功構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白雙順反子的pSELECT-GFPzeo-β-NGF真核表達(dá)載體；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞CHO-K1獲得持續(xù)表達(dá)NGF蛋白的CHO-K1種子細(xì)胞系，經(jīng)培養(yǎng)所分泌目的蛋白可有效促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖，具有較強的生物學(xué)活性；

8、r>　　 2.基于天然生物高分子殼聚糖基材料成功制備出新型pH敏感互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的HTCC/GP水凝膠，該水凝膠材料具有良好生物相容性、溶脹性，能夠響應(yīng)pH環(huán)境控制蛋白藥物釋放；
　　 3.成功構(gòu)筑負(fù)載轉(zhuǎn)基因CHO-K1種子細(xì)胞的水凝膠三維復(fù)合物，研究表明該支架材料可為種子細(xì)胞在支架材料上黏附、增殖及細(xì)胞間通訊提供理想的微環(huán)境，有望在潰瘍表面形成一個仿生皮膚環(huán)境以調(diào)控糖尿病潰瘍再生修復(fù)過程，為針對潰瘍局部微環(huán)境特征設(shè)計組織工程皮