AMPK對BMP信號通路以及異位骨化的抑制作用.pdf

1、第一部分引言
　　異位骨化（Heterotopic ossification,HO）是指在軟組織中病理形成異常的骨組織。一般發(fā)生在兩個單獨的患者群體中：具有嚴重創(chuàng)傷包括大面積燒傷、肌肉骨骼損傷、矯形手術甚至脊髓損傷的患者;和進行性肌肉骨化癥（Fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP）等遺傳性疾病患者中。FOP由I型骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ Bone morphogenetic proteins,B

2、MP）受體 ALK2（ Activin receptor-like kinase2,活化素1型受體）中的永久性活化突變引起。這些病理性異位骨形成的臨床后遺癥，包括非愈合性創(chuàng)傷、慢性疼痛和關節(jié)不動性。對于FOP，患者由于胸廓順應性的損失導致呼吸困難而死亡。
　　BMPs以及其轉導的信號通路在異位骨化形成中具有重要作用。BMPs是異位骨化的主要誘導者；軟組織創(chuàng)傷后刺激BMPs分泌和激活BMP信號通路，促進軟組織形成HO。此外,大約95

3、％的FOP患者發(fā)生BMPI型受體(ALK2)突變（R206H），引起B(yǎng)MP信號通路持續(xù)性激活，表現為漸近性異位骨化的特性。
　　異位骨化是一個非常普遍和嚴重的健康問題，目前臨床上使用的方法一般是減少疼痛，修復以及預防。大多依賴于抗炎藥物的使用，但其效果充其量是部分有效。而且大量的副作用限制了NSAIDs的使用。一個有效的、理想的策略是特異性的針對BMP信號通路成分，抑制異位骨化，另一個有創(chuàng)新性的策略是鑒定現有臨床上治療其他藥物，重

4、新發(fā)現其治療效果來滿足臨床需求。
　　眾多研究表明AMP-激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在骨代謝中發(fā)揮重要的生理作用，AMPK激活劑二甲雙胍是2型糖尿病一線藥物，已經在臨床上廣泛使用超過半個世紀。我們課題組前期已經發(fā)現二甲雙胍能夠有效性的抑制 TGFβ家族信號轉導和 EMT。繼續(xù)延伸此研究，探索 AMPK對BMP信號通路以及異位骨化的作用。因此，我們首先研究了AMPK對FOP成纖

5、維細胞中BMP信號通路的抑制作用以及分子機制；然后將FOP成纖維細胞誘導成多能干細胞（iPS cells），進行成骨分化誘導，進一步檢測了AMPK對成骨分化的抑制作用；為了探索不同細胞的反應性，繼續(xù)檢測AMPK對MC3T3-E1細胞 BMP信號通路的影響和作用機制，研究不同 AMPK激活劑（單獨使用或者聯合使用）對成骨分化的影響，確定劑量效應和協同效應；最后建立小鼠異位骨化模型以及檢測AMPK激活劑對體內異位骨化的抑制作用。我們的研究結

6、果明確 AMPK對 BMP信號通路以及成骨分化和異位骨化的抑制作用，也為現有臨床使用的AMPK激活劑如二甲雙胍、阿司匹林用于預防、治療FOP疾病和異位骨化提供科學依據。
　　第二部分 AMPK對FOP成纖維細胞中BMP信號通路的抑制作用
　　目的：檢測AMPK激活是否抑制BMP信號通路轉導以及探索AMPK可能的作用機制。
　　方法：DNA測序檢測 FOP成纖維細胞是否發(fā)生 ALK2 R206H突變;不同AMPK激活劑處

7、理FOP細胞，Western blot檢測AMPK對BMP信號通路成分表達的影響；構建LKB1、AMPK12穩(wěn)定敲除MEF細胞株，觀察不同細胞株對BMP和二甲雙胍的反應性；感染持續(xù)性激活AMPK腺病毒激活AMPK和顯示負性AMPK腺病毒失活AMPK，確定二甲雙胍對BMP的信號通路作用是通過AMPK介導的；構建熒光素酶互補結合實驗系統(tǒng)，觀察AMPK對Smad6與Smurf1、ALK2與Smad1相互作用的影響；轉染Smad6 siRNA和

8、Smurf1 siRNA以及用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，探索AMPK對BMP信號通路抑制作用的分子機制。
　　結果：DNA測序確認FOP成纖維細胞發(fā)生ALK2 R206H突變；不同AMPK激活劑激活AMPK并且抑制Smad1/5的磷酸化；感染持續(xù)性激活AMPK突變體抑制 BMP信號轉導，而感染 AMPK顯性負性突變體后，取消了二甲雙胍對Smad1/5磷酸化的抑制作用；穩(wěn)定敲除LKB1和AMPK12表達后，二甲雙胍不能抑制B

9、MP6誘導的Smad1/5的磷酸化。AMPK激活抑制ALK2的表達但上調Smad6和Smurf1的表達；AMPK激活后促進Smad6和Smurf1的結合，但阻遏ALK2和Smad1的相互作用；Smad6和Smurf1基因沉默后，消除了AMPK對BMP信號通路的抑制作用。此外，結果還顯示蛋白酶體抑制MG132能夠消除AMPK促進ALK2降解的作用。
　　結論：AMPK激活劑或者使用持續(xù)性激活 AMPK突變體激活 AMPK抑制Smad

10、1/5的磷酸化；二甲雙胍對Smad1/5的磷酸化抑制是通過AMPK介導的；AMPK激活抑制 FOP成纖維細胞中 BMP信號通路轉導，AMPK激活后上調Smad6和Smurf1表達、增強兩個分子之間的相互作用，隨后引起ALK2降解增加，從而抑制BMP信號轉導。
　　第三部分 AMPK抑制來源于FOP成纖維細胞的iPS的成骨分化
　　目的：研究AMPK激活對來源于FOP成纖維細胞的iPS的成骨分化影響。
　　方法：建立、鑒

11、定來源于 FOP成纖維細胞的誘導多能干細胞（FOP-iPS）;誘導iPS細胞向成骨細胞分化,通過茜素紅染色和Western blot檢測成骨分化標記物表達來觀察ALK2突變(FOP iPS)和野生型ALK2(Control iPS)的iPS誘導成骨細胞分化能力的區(qū)別；采用茜素紅染色檢測AMPK激活劑（二甲雙胍、AICAR）對iPS細胞礦化的影響。
　　結果：成功構建來源于FOP成纖維細胞的iPS細胞(FOP iPS);與對照iPS

12、相比較，FOP iPS茜素紅染色程度更強，成骨分化標記物RunX2、Osx和OPN表達水平更高；AMPK激活劑二甲雙胍、AICAR抑制iPS誘導的細胞礦化。
　　結論：攜帶ALK2突變的FOP iPS細胞誘導成骨細胞分化的能力更強;AMPK抑制來源于FOP成纖維細胞的iPS的成骨分化。
　　第四部分 AMPK對小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞中BMP信號通路的抑制作用
　　目的：探討AMPK對MC3T3-E1細胞中B

13、MP信號通路的影響以及探索可能的分子作用機制。
　　方法：AMPK激活劑二甲雙胍處理MC3T3-E1細胞不同時間或者不同濃度， Western blot檢測AMPK對BMP信號通路成分表達的影響,觀察AMPK對Smad6、Smurf1和ALK2等表達的改變；感染持續(xù)性激活AMPK腺病毒激活AMPK，觀察AMPK對BMP信號通路的直接效應；轉染Smad6 siRNA，沉默Smad6表達，探索AMPK對BMP信號通路抑制作用的分子機制

14、。
　　結果：二甲雙胍和持續(xù)性激活AMPK突變體激活AMPK抑制BMP6誘導的Smad1/5的磷酸化；AMPK激活后上調Smad6表達但不改變Smurf1和ALK2的表達；Smad6基因沉默后，二甲雙胍不能抑制BMP6誘導的Smad1/5的磷酸化， 消除了AMPK對BMP信號通路的抑制作用。
　　結論：AMPK激活抑制MC3T3-E1細胞中BMP信號通路轉導，AMPK激活后通過上調Smad6表達，抑制BMP信號轉導

15、,Smad6是AMPK主要靶目標。
　　第五部分 AMPK抑制MC3T3-E1細胞成骨分化
　　目的：探討AMPK對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響。
　　方法：MC3T3-E1細胞培養(yǎng)在誘導成骨分化培養(yǎng)基中誘導細胞向成骨細胞分化，分別采用Western bolt和qPCR檢測不同時間段（0、1、3、7、14、21天） AMPK活性和成骨細胞分化標記物OPN、Osx和Runx2的改變；觀察AMPK活性和成骨分化之間的

16、關系；感染持續(xù)性激活AMPK腺病毒激活AMPK和顯性負性AMPK腺病毒失活AMPK，觀察AMPK對堿性磷酸酶活性的影響;堿性磷酸酶染色檢測不同AMPK激活劑（單獨使用或者聯合使用）對成骨分化早期階段的影響；茜素紅染色檢測不同AMPK激活劑對成骨分化晚期階段-細胞礦化的影響。
　　結果：AMPK活性隨著成骨細胞分化程度越高其活性逐漸降低，而成骨細胞分化標記物OPN和Osx在第14天呈現最高表達，Runx2在成骨分化期間表達未發(fā)生明顯

17、改變；AMPK激活劑包括二甲雙胍、阿司匹林、姜黃素和布洛芬等抑制堿性磷酸酶活性，并呈現濃度依賴性；感染AMPK持續(xù)性活性突變體也顯示同樣效應，然而感染AMPK顯性負性突變體失活AMPK活性和功能后，取消二甲雙胍對堿性磷酸酶活性的抑制作用；二甲雙胍和布洛芬聯用對堿性磷酸酶活性抑制具有超疊加效應，而二甲雙胍和姜黃素聯用顯示疊加效應。二甲雙胍和阿司匹林抑制MC3T3-E1細胞礦化，并呈現濃度依賴性。
　　結論：AMPK在成骨細胞分化過程

18、中發(fā)揮重要作用，成骨分化程度越高， AMPK活性越低；AMPK激活抑制MC3T3-E1成骨細胞分化,包括早期階段和晚期階段。二甲雙胍和布洛芬聯合應用具有超疊加效應可能通過不同機制抑制堿性磷酸酶活性。二甲雙胍和姜黃素聯用具有疊加效應可能通過相似機制抑制堿性磷酸酶活性。
　　第六部分 AMPK對小鼠體內異位骨化形成的影響
　　目的：初步探討AMPK對小鼠體內異位骨化形成的影響。
　　方法：建立創(chuàng)傷-燒傷異位骨化小鼠模型，同

19、時采用二甲雙胍干預（飲用水含有0.5mg/ml的二甲雙胍，N=5），連續(xù)8周后，采用X-RAY掃描檢測異位骨的形成；取異位骨化組織，固定，脫鈣，進行HE染色觀察組織學改變，阿爾新藍（Alcian Blue）染色檢測二甲雙胍對軟骨內形成改變；qPCR檢測成骨細胞分化標記物（包括Osc、BSP、RunX2）以及Smad6、Smurf1的mRNA表達的改變。
　　結果：通過創(chuàng)傷-燒傷方法成功建立小鼠異位骨化模型，術后8周，進行X-RAY