Shugoshin1在非小細(xì)胞肺癌多西紫杉醇耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是目前全世界死亡率最高的惡性腫瘤。絕大多數(shù)患者就診時已為晚期,喪失手術(shù)機(jī)會?；熓沁@類患者的主要治療手段,其中紫杉類藥物是目前非小細(xì)胞肺癌化療中最常用且有顯著療效的新一代藥物,但在治療過程中腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生耐藥性是化療失敗的主要原因。因此,如何克服非小細(xì)胞肺癌對紫杉類藥物的耐藥是肺癌治療過程中亟需解決的重要問題。目前對紫杉類藥物耐藥機(jī)制的研究包括P-gp蛋白,MRP蛋白的高表達(dá),微管β亞基及α亞基的突變,凋亡基因的改變及細(xì)胞DNA修

2、復(fù)系統(tǒng)的加強(qiáng)等等。但上述機(jī)制仍不能圓滿解釋腫瘤的MDR現(xiàn)象。SGO1是我們前期研究中利用CellomicsArrayScan平臺篩選出的一個肺癌相關(guān)新分子。在前期的研究發(fā)現(xiàn):SGO1(shugoshin-1)可能是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的關(guān)鍵分子,研究中還發(fā)現(xiàn)SGO1主要影響細(xì)胞分裂G2/M期,而紫杉類藥物正是通過阻滯腫瘤細(xì)胞停留在G2/M期來發(fā)揮細(xì)胞毒性作用,但其與紫衫類藥物耐藥的關(guān)系還尚未有任何研究報道。進(jìn)而我們用化療藥物多西紫杉醇通

3、過瞬時反復(fù)作用的方法篩選出多西紫杉醇耐藥的細(xì)胞株A549/Taxotere并檢測SGO1的表達(dá),進(jìn)一步通過構(gòu)建SGO1表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞亞系,研究SGO1在非小細(xì)胞肺癌多西紫杉醇耐藥中的作用,為SGO1逆轉(zhuǎn)多西紫杉醇耐藥提供證據(jù)。
　　目的:
　　1.培養(yǎng)對多西紫杉醇耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/Taxotere,檢測其SGO1的表達(dá)。2.構(gòu)建SGO1表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞亞系,研究SGO1在非小細(xì)

4、胞肺癌多西紫杉醇耐藥中的作用。
　　3.進(jìn)一步研究SGO1影響非小細(xì)胞肺癌多西紫杉醇的耐藥機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過RT-PCR,Westernblot檢測A549/Taxotere中SGO1的表達(dá)。
　　2.通過構(gòu)建SGO1的si-RNA質(zhì)粒和正義表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝分別轉(zhuǎn)染A549/Taxotere及親本A549細(xì)胞,分別命名為siSGO1-LV-A549/Taxotere和SGO1-LV-A549利用

5、Western-blot及RT-qPCR鑒定其干預(yù)效果。
　　3.利用MTT比色法觀察外源性改變SGO1的表達(dá)后,SGO1-LV-A549及siSGO1-LV-A549/Taxotere對多西紫杉醇藥物敏感性的影響。
　　4.通過AnnexinV/PI染色法檢測SGO1上調(diào)及下調(diào)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中多西紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的變化,并計算凋亡指數(shù)。
　　5.借助流式細(xì)胞儀檢測SGO1上調(diào)及下調(diào)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中多西紫

6、杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的變化。
　　6.利用RT-qPCR和Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染SGO1正義表達(dá)細(xì)胞株和小干擾RNA載體細(xì)胞株中P-gp,Bcl-2,Bax的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.SGO1在多西紫杉醇耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549/Taxotere中mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高。
　　2.與對照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染正義SGO1表達(dá)載體的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對多西紫杉醇敏感性明顯降低;加藥后

7、,G2/M期細(xì)胞比例明顯增減;多西紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少,轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)顯著增強(qiáng),Bax的表達(dá)顯著減弱;細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)增加(P<0.05)。
　　3.與對照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染SGO1siRNA的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞能明顯逆轉(zhuǎn)對多西紫杉醇的抵抗;加藥后,G2/M期細(xì)胞相應(yīng)增加;多西紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加,轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)減弱,Bax的表達(dá)明顯增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)降低(P<0.05)。

8、　　結(jié)論:
　　1.SGO1高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對多西紫杉醇的耐藥密切相關(guān)。
　　2.成功建立SGO1上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株,其通過抑制促凋亡分子Bax的表達(dá),增強(qiáng)抑制凋亡分子Bcl-2的表達(dá)來降低化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,通過減少G2/M期阻滯,增加P-gp蛋白表達(dá)這些途徑降低細(xì)胞對多西紫杉醇的敏感性。
　　3.成功建立SGO1下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株,其通過上調(diào)促凋亡分子Bax的表達(dá),下調(diào)抑制凋亡分子Bcl-2的表