多西紫杉醇對肺腺癌細胞系A(chǔ)549及其多藥耐藥細胞系A(chǔ)549-CDDP的作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的：(1)誘導(dǎo)建立人肺腺癌多藥耐藥細胞系A(chǔ)549/CDDP；(2)觀察多西紫杉醇對肺腺癌細胞A549及其多藥耐藥細胞A549/CDDP的生長抑制作用、細胞周期影響和誘導(dǎo)凋亡作用；(3)初步探討bcl-2、bax、Fas、p53、c-myc等凋亡相關(guān)蛋白在多西紫杉醇抗腫瘤作用機制中的作用。 方法：(1)以人肺腺癌細胞系A(chǔ)549為誘導(dǎo)對象，順鉑為誘導(dǎo)藥物，采用恒定藥物濃度、周期性作用的方法，建立在1μg/ml順鉑作用下生長良好的耐

2、藥系A(chǔ)549/CDDP。應(yīng)用MTT法檢測耐藥細胞及其親代細胞對不同化療藥物的敏感性，倒置顯微鏡及透射電鏡觀察其細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測其細胞周期。(2)應(yīng)用光鏡、透射電鏡、集落形成試驗和MTT法等，檢測耐藥細胞及其親代細胞在多西紫杉醇作用后形態(tài)學(xué)、細胞生長曲線、集落形成能力和生長抑制率的變化；應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期變化；應(yīng)用透射電鏡、TUNEL、AnnexinV/PI雙染法觀察多西紫杉醇誘導(dǎo)細胞凋亡。(3)應(yīng)用SP細胞免疫化學(xué)方法，

3、檢測bcl-2、bax、Fas、p53、c-myc等凋亡相關(guān)蛋白在多西紫杉醇作用A549及A549/CDDP細胞前后的表達情況。 結(jié)果：(1)成功誘導(dǎo)建立了人肺腺癌多藥耐藥細胞系A(chǔ)549/CDDP。MTT藥物敏感性檢測結(jié)果表明，A549/CDDP細胞對順鉑、羥基喜樹堿、長春新堿和5-氟尿嘧啶等4種化療藥物有不同程度的耐受性，其耐藥指數(shù)分別為12.00、2.29、8.6、16.84。細胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，相對親代細胞，耐藥細胞體積

4、偏大，分化較好，核仁大而多，核漿比例大，線粒體短小且具有老化、退變現(xiàn)象，同時胞質(zhì)內(nèi)可見較多空泡和板層小體。細胞生長曲線和細胞倍增時間測定結(jié)果表明，耐藥細胞與其親代細胞增殖速度接近，細胞周期結(jié)果顯示耐藥細胞較親代細胞S期明顯增多(P＜0.05)。(2)多西紫杉醇對A549及A549/CDDP細胞均具有明顯的生長抑制作用，并在0.1～2μg/ml劑量范圍內(nèi)存在劑量及時間依賴關(guān)系。A549/CDDP細胞在多西紫杉醇作用12～24h較親代細胞敏

5、感(P＜0.01)，在48h較親代細胞耐受(P＜0.01)，在72h則與親代細胞間無顯著性差異(P＞0.05)。(3)多西紫杉醇對A549及A549/CDDP細胞均具有顯著的G2/M期阻滯作用，親代細胞還表現(xiàn)出時間依賴性，而耐藥細胞于48h后出現(xiàn)四倍體細胞，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大量多微核化細胞。加大藥物劑量后兩種細胞G2/M期細胞均顯著減少，同時出現(xiàn)S期細胞明顯增多即S期阻滯。(4)多西紫杉醇能誘導(dǎo)A549和A549/CDDP細胞凋亡、壞

6、死和胞質(zhì)自切，并以后兩者為主。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，微絨毛減少甚至消失，線粒體出現(xiàn)腫脹甚至空泡化，同時，還存在少數(shù)凋亡小體和脫落的不含細胞器成分的細胞質(zhì)。(5)A549及A549/CDDP細胞均表達Fas、c-myc和p53蛋白，但A549/CDDP細胞還弱表達和表達bax和bcl-2蛋白。多西紫杉醇作用后，兩種細胞Fas表達均明顯增強，耐藥細胞bax表達也有所增強，而其余蛋白表達無明顯變化。 結(jié)論：(1)所