豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)調(diào)控基因的分離與鑒定.pdf

1、目前，從分子水平上進行豬的品種選育已經(jīng)成為可能，但是對對肌內(nèi)脂肪沉積的分子調(diào)節(jié)機制仍缺乏系統(tǒng)的了解.本研究通過差異顯示逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應( DDRT-PCR)的方法鑒定在肌內(nèi)脂肪含量差異極顯著的個體間背最長肌差異表達的基因，其目的在于尋找參與肌內(nèi)脂肪沉積調(diào)控的相關(guān)基因，并為豬的肌內(nèi)脂肪性狀選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 實驗一：從90頭180日齡蘇太豬中(平均肌內(nèi)脂肪含量2.72±0.13％)分別選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低各6個

2、個體組成兩組，其平均肌內(nèi)脂肪含量分別為5.79％±0.35％和0.98％±0.09‰組間差異極顯著(p<0.01).采用3條錨定引物，12條隨機引物組成36種引物組合進行DDRT-PCR，共獲得14條差異表達條帶，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)其中4條序列與已知基因高度同源.分別命名為clonel(691bp)，clone2(160bp)，clone3(350 bp)，clone4(550 bp).clonel與肌內(nèi)脂肪含量存在正相關(guān)，并與人剪切

3、因子絲氨酸-精氨酸富集蛋白SRrp130高度同源，同源性為99％，clone2.clone3，clone4與肌內(nèi)脂肪含量負相關(guān)，并分別與豬主要組織相容性抗原I基因(SLA-1)，人細胞核受體共激活因子1基因(SRC-1)，豬肌動蛋白重鏈2b基因(MYH2b)一致或高度同源，同源性分別為100％，94％，100％.對clonel進行電子延伸并進行部分測序，獲得豬SRrp130基因完整開放閱讀框3227bp序列，編碼805個氨基酸。

4、 最后從90個個體中選取肌內(nèi)脂肪最高和最低的各15個個體組成兩組，肌內(nèi)脂肪平均含量分另q為4.46％±0.29％和166％±0.16％(p<0.05)，通過RT-PCR和real timePCR定性和定量檢測各基因表達水平，定量結(jié)果顯示SRrp130，SRC-1基因表達模式與差顯結(jié)果相似.SRrp130 mRNA表達水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.54P<0.01)，SRC-1表達水平與肌內(nèi)脂肪含量呈負相關(guān)(r=-0.38，P<

5、0.05)。 實驗二：第一部分實驗鑒定出的SRC-1/NCOA1基因與肌內(nèi)脂肪含量之間存在密切關(guān)系，該基因為細胞核受體共激活因子p160家族的一個成員，該家族包括3個成員，它們分別為NCOA1，NCOA2和NCOA3基因，，最近通過對小鼠中這三個成員的敲除發(fā)現(xiàn)它們在能量代謝中發(fā)揮重要作用.這部分研究首先克隆了NCOA2和NCOA3的完整開放閱讀框，在此基礎(chǔ)上研究它們的表達水平與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。 實驗選取180日齡的長

6、白豬和大約克豬雜交F1代個體.通過比較基因組學的方法，采用人的NCOA2和NCOA3基因調(diào)取豬的EST序列，以此為模板設(shè)計引物進行PCR擴增并測序，獲得了它們完整的開放閱讀框，分別為7，628 bp的NCOA2基因(EU346672)以及5，005 bp的NCOA3基因(EU346674).同時在分析的過程中，發(fā)現(xiàn)了NCOA2的第二種剪切體，獲得了含完整開放閱讀框的7421bp的NCOA2基因選擇性剪切體2(EU346673)。

7、 雖然豬的NCOA1基因已經(jīng)公布(DQ078269)，但是NCOA1 mRNA在人上目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有不同開放閱讀框的3種選擇性剪切體，在小鼠中也只有一種剪切體。為了驗證豬背最長肌中是否表達其他的剪切體，本實驗通過電子延伸和部分測序?qū)COA1.mRNA進行了研究，結(jié)果鑒定出含有不同開放閱讀框的兩種新剪切體(EU346670，EU346671)，長度分別為6534bp和6591bp。 對這個家族的所有3個成員以及它們的剪切體進行

8、氨基酸序列比對，首次發(fā)現(xiàn)NCOA2選擇性剪切體2比其他成員少一個核心功能基序LXXLL，這一功能區(qū)主要參與了共激活因子對細胞核受體的選擇以及對細胞核受體的特異性， 從所有的60頭F1代個體中選取肌內(nèi)脂肪最高和最低的各15頭個體組成肌內(nèi)脂肪含量差異顯著的兩組，肌內(nèi)脂肪平均含量分別為3.12％±0.19％和1.21％±0.15％(P<0.05)，采用real time PCR檢測p160家族成員及剪切體的表達水平.定量結(jié)果顯示NCO

9、A1總表達量(r=-0.516，p<0.01)及選擇性剪切體2(r=-0.554，p<0.01)與肌內(nèi)脂肪沉積量負相關(guān)，而NCOA2選擇性剪切體1(r=0.605，p<0.01)和NCOA3(r=0.435，p<0.05)與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，組間表達差異顯著(P<0.05)。 通過基因組比較，確定NCOA2基因位于豬4號染色體的65cM處，處于已報道肌內(nèi)脂肪QTL峰值區(qū)域，另外在牛中該基因位于14號染色體上大理石紋QTL區(qū)域