豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)調(diào)控基因的分離與鑒定.pdf

1、目前，從分子水平上進(jìn)行豬的品種選育已經(jīng)成為可能，但是對(duì)對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的分子調(diào)節(jié)機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)的了解.本研究通過(guò)差異顯示逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( DDRT-PCR)的方法鑒定在肌內(nèi)脂肪含量差異極顯著的個(gè)體間背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)的基因，其目的在于尋找參與肌內(nèi)脂肪沉積調(diào)控的相關(guān)基因，并為豬的肌內(nèi)脂肪性狀選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 實(shí)驗(yàn)一：從90頭180日齡蘇太豬中(平均肌內(nèi)脂肪含量2.72±0.13％)分別選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低各6個(gè)

2、個(gè)體組成兩組，其平均肌內(nèi)脂肪含量分別為5.79％±0.35％和0.98％±0.09‰組間差異極顯著(p<0.01).采用3條錨定引物，12條隨機(jī)引物組成36種引物組合進(jìn)行DDRT-PCR，共獲得14條差異表達(dá)條帶，通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中4條序列與已知基因高度同源.分別命名為clonel(691bp)，clone2(160bp)，clone3(350 bp)，clone4(550 bp).clonel與肌內(nèi)脂肪含量存在正相關(guān)，并與人剪切

3、因子絲氨酸-精氨酸富集蛋白SRrp130高度同源，同源性為99％，clone2.clone3，clone4與肌內(nèi)脂肪含量負(fù)相關(guān)，并分別與豬主要組織相容性抗原I基因(SLA-1)，人細(xì)胞核受體共激活因子1基因(SRC-1)，豬肌動(dòng)蛋白重鏈2b基因(MYH2b)一致或高度同源，同源性分別為100％，94％，100％.對(duì)clonel進(jìn)行電子延伸并進(jìn)行部分測(cè)序，獲得豬SRrp130基因完整開放閱讀框3227bp序列，編碼805個(gè)氨基酸。

4、 最后從90個(gè)個(gè)體中選取肌內(nèi)脂肪最高和最低的各15個(gè)個(gè)體組成兩組，肌內(nèi)脂肪平均含量分另q為4.46％±0.29％和166％±0.16％(p<0.05)，通過(guò)RT-PCR和real timePCR定性和定量檢測(cè)各基因表達(dá)水平，定量結(jié)果顯示SRrp130，SRC-1基因表達(dá)模式與差顯結(jié)果相似.SRrp130 mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.54P<0.01)，SRC-1表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.38，P<

5、0.05)。 實(shí)驗(yàn)二：第一部分實(shí)驗(yàn)鑒定出的SRC-1/NCOA1基因與肌內(nèi)脂肪含量之間存在密切關(guān)系，該基因?yàn)榧?xì)胞核受體共激活因子p160家族的一個(gè)成員，該家族包括3個(gè)成員，它們分別為NCOA1，NCOA2和NCOA3基因，，最近通過(guò)對(duì)小鼠中這三個(gè)成員的敲除發(fā)現(xiàn)它們?cè)谀芰看x中發(fā)揮重要作用.這部分研究首先克隆了NCOA2和NCOA3的完整開放閱讀框，在此基礎(chǔ)上研究它們的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)選取180日齡的長(zhǎng)

6、白豬和大約克豬雜交F1代個(gè)體.通過(guò)比較基因組學(xué)的方法，采用人的NCOA2和NCOA3基因調(diào)取豬的EST序列，以此為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，獲得了它們完整的開放閱讀框，分別為7，628 bp的NCOA2基因(EU346672)以及5，005 bp的NCOA3基因(EU346674).同時(shí)在分析的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了NCOA2的第二種剪切體，獲得了含完整開放閱讀框的7421bp的NCOA2基因選擇性剪切體2(EU346673)。

7、 雖然豬的NCOA1基因已經(jīng)公布(DQ078269)，但是NCOA1 mRNA在人上目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有不同開放閱讀框的3種選擇性剪切體，在小鼠中也只有一種剪切體。為了驗(yàn)證豬背最長(zhǎng)肌中是否表達(dá)其他的剪切體，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電子延伸和部分測(cè)序?qū)COA1.mRNA進(jìn)行了研究，結(jié)果鑒定出含有不同開放閱讀框的兩種新剪切體(EU346670，EU346671)，長(zhǎng)度分別為6534bp和6591bp。 對(duì)這個(gè)家族的所有3個(gè)成員以及它們的剪切體進(jìn)行

8、氨基酸序列比對(duì)，首次發(fā)現(xiàn)NCOA2選擇性剪切體2比其他成員少一個(gè)核心功能基序LXXLL，這一功能區(qū)主要參與了共激活因子對(duì)細(xì)胞核受體的選擇以及對(duì)細(xì)胞核受體的特異性， 從所有的60頭F1代個(gè)體中選取肌內(nèi)脂肪最高和最低的各15頭個(gè)體組成肌內(nèi)脂肪含量差異顯著的兩組，肌內(nèi)脂肪平均含量分別為3.12％±0.19％和1.21％±0.15％(P<0.05)，采用real time PCR檢測(cè)p160家族成員及剪切體的表達(dá)水平.定量結(jié)果顯示NCO

9、A1總表達(dá)量(r=-0.516，p<0.01)及選擇性剪切體2(r=-0.554，p<0.01)與肌內(nèi)脂肪沉積量負(fù)相關(guān)，而NCOA2選擇性剪切體1(r=0.605，p<0.01)和NCOA3(r=0.435，p<0.05)與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，組間表達(dá)差異顯著(P<0.05)。 通過(guò)基因組比較，確定NCOA2基因位于豬4號(hào)染色體的65cM處，處于已報(bào)道肌內(nèi)脂肪QTL峰值區(qū)域，另外在牛中該基因位于14號(hào)染色體上大理石紋QTL區(qū)域