絨山羊肌內脂肪沉積特征及脂肪細胞分化機理的研究.pdf

1、肌內脂肪含量是影響絨山羊肉品質的一個關鍵指標，直接關系到絨山羊的經濟價值與肉用價值。內蒙古絨山羊膽固醇含量低、味美多汁，表現出優(yōu)良的肉品質性狀。因此，本研究以內蒙古白絨山羊為試驗動物模型，探討不同部位肌肉組織中肌內脂肪含量的沉積規(guī)律以及脂肪沉積代謝相關基因表達的變化特點，并在體外構建絨山羊肌內前體脂肪細胞，進行誘導分化，在細胞水平上對分化過程中成脂基因的表達模式進行研究。利用RNAi技術在轉錄水平上初步鑒定PPARγ基因調控絨山羊脂肪沉

2、積的內在機制。在此研究基礎上構建肌內前體脂肪細胞、成熟脂肪細胞、干擾組脂肪細胞和對照組脂肪細胞的RNA文庫，應用IlluminaMiSeq測序技術對其進行高通量測序，利用生物信息學軟件從測序評估、差異基因功能注釋、可變剪接等方面進行分析，篩選調控脂肪沉積的關鍵基因。為肉用家畜肉質性狀轉基因育種提供更為廣泛的基因來源。主要研究結果如下:
　　1、脂肪沉積關鍵基因在不同肌肉組織中的表達情況與IMF相關性分析PPARγ基因的表達具有組織

3、特異性，在膈肌、背最長肌、胸下矩肌和股四頭肌中的表達量最高，極顯著的高于半腱肌、股二頭肌、腰大肌和腹外斜肌(P＜0.01)。其次在肋間肌和斜方肌中的表達量也較高。FTO基因的表達水平要明顯高于其他基因，在股四頭肌和斜方肌中的表達量極顯著高于其他部位，且兩者之間有顯著差異，背最長肌和腹外斜肌等部位中的表達量較低。相反，lipin基因在不同肌肉組織中的表達量較低，膈肌和胸下矩肌中的表達量較高，其次是在肋間肌、股四頭肌和腰大肌，而腹外斜肌、背

4、最長肌、半腱肌、斜方肌和股二頭肌中的表達量極低。LPL和HSL是脂肪合成和分解的關鍵酶類，其表達趨勢大致相同，僅僅在腰大肌和斜方肌這兩個部位的表達模式相反。A-FABP和Perilipin基因表達模式也較為特殊，整體表達量較低，組織之間無顯著差異，前者僅僅在胸下矩肌中有較高表達，后者是在股二頭肌?？傮w上看絨山羊PPARγ基因mRNA與肌內脂肪呈負相關;而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、lipin、perilipin、A-FABP基因

5、mRNA與肌內脂肪含量呈正相關。
　　2、絨山羊肌內前體脂肪細胞的構建及分化過程中脂肪沉積關鍵基因的表達情況
　　采集1日齡絨山羊背最長肌，利用Ⅱ膠原酶消化法分離獲得均一性良好，呈梭型的絨山羊肌內前體脂肪細胞。體外添加IBMX+DEX+INS，誘導細胞成脂分化，油紅O染色可見胞內紅色脂滴。RT-PCR檢測脂肪沉積關鍵基因在前體脂肪細胞分化的早(D3)、中(D7)末(D11)三個時期，及誘導分化關鍵時間點(24h、48h、72

6、h、96h)的表達，其中FTO基因在各個時間點顯著高于其他基因的表達水平;LPL、lipin、PPARγ、A-FABP和perilipin的表達模式相似，隨著前體脂肪細胞培養(yǎng)日齡的增加和甘油三酯的積聚，其表達量逐漸升高;LPL基因在脂肪細胞分化的早期表達量最高，之后表達量有所降低，但一直維持高表達量的趨勢;PPARγ隨細胞誘導分化過程其表達量也逐漸升高，48h表達水平最高;A-FABP基因同PPARγ表達模式一致;lipin基因在各個時

7、間點的表達豐度極低;HSL的表達量隨分化程度的升高而逐漸降低;perilipin基因僅僅在誘導分化的后期有較高表達。
　　3、沉默PPARγ基因對脂肪細胞增殖和分化的影響
　　為了證明PPARγ基因在脂肪細胞分化過程中的重要作用。本研究首次構建山羊shRNA-PPARγ慢病毒干擾載體，對肌內脂肪細胞的感染效率為80％，熒光定量和Western blot檢測慢病毒載體介導的shRNA可以有效的降低PPARγ的表達，發(fā)現其mRN

8、A水平和蛋白水平的作用時間相隔24h。沉默PPARγ基因后脂肪細胞內甘油三酯濃度明顯低于對照組脂肪細胞，表明其分化能力顯著降低;通過MTT檢測，干擾組細胞較對照組細胞增殖能力反而增強。其他脂肪細胞分化的相關基因LPL、FTO、A-FABP和perilipin基因的表達量隨著PPARγ基因表達量的下調出現不同程度的降低，而HSL和lipin基因未檢測到明顯變化。由此可見PPARγ基因在脂肪細胞分化過程的調控中心位置，發(fā)揮著調控其他基因表達

9、的關鍵作用。
　　4、肌內脂肪細胞成熟前后、干擾前后比較轉錄組分析
　　本研究基于RNA-seq高通量測序技術，得到16G表達譜數據，通過TopHat軟件對肌內前體脂肪細胞、成熟脂肪細胞，shRNA-PPARγ脂肪細胞和對照組脂肪細胞4個樣本兩兩比對篩選到表達量差異4倍以上的基因分別為152、450、456、412、39和445個，其中pref-1、FGF、TGF、TNF、RA、IL-21B和EGF等抑制脂肪沉積的基因在sh

10、RNA-PPARγ干擾組肌內脂肪細胞中有較高表達。對這些差異基因進行GO分類和KGEE通路的初步分析，富集到與脂肪細胞分化有關的10條通路，差異最為顯著的是PPARγ信號通路、Wnt信號通路、mTOR信號通路和MAPK信號通路。其中有六個基因LPL、FABP、FATP、AP2、RXRG和CD36富集到了PPARγ信號通路中，它們在成熟脂肪細胞中的表達量顯著高于前體脂肪細胞，這與在細胞基礎上的研究結果一致，表明這些基因可作為絨山羊肌內脂肪