人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究及基因差異表達(dá)的微陣列分析.pdf

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究及差異表達(dá)基因的微陣列分析 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞，已有實(shí)驗(yàn)證明在體內(nèi)和體外細(xì)胞因子作用下，可分化為骨、軟骨和脂肪細(xì)胞，在體內(nèi)參與組織更新、損傷的修復(fù)和重建。本研究探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的可能性。 1.材料和方法1.1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)人骨髓標(biāo)本來(lái)源于39歲男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常規(guī)方法，抽取骨髓液5ml。肝素抗凝。DMEM+F12

2、培養(yǎng)液稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(比重為1.077)密度梯度離心法，分離出單個(gè)核細(xì)胞。用DMEM+F12洗滌后，加入DMEM+F12與MCBD的混合培養(yǎng)液(3：2，V/V)，并加入10％胎牛血清(FCS)、2ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、10ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和雙抗。24小時(shí)后，吸取培養(yǎng)液，連同未貼壁細(xì)胞棄去。貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每四天更換半量的培養(yǎng)液，1

3、2天后細(xì)胞融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液消化后，細(xì)胞傳代，每天觀察生長(zhǎng)情況。 1.2.誘導(dǎo)分化細(xì)胞傳至第四代后，在培養(yǎng)液中加量bFGF至10ng/ml，加10ng/mlVEGF培養(yǎng)，每四天半量換液，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，于第0、14、24天分析細(xì)胞的表型和功能。 1.3流式細(xì)胞分析細(xì)胞收集后，用多聚甲醛固定后用流式細(xì)胞分析儀，分析CD34、CD45、CD54、CD106、HLA-DR、vWF及KD

4、R的表達(dá)情況。 1.4ac-LDL攝取和UEA結(jié)合試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間，在消化傳代時(shí)，在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放入適當(dāng)大小蓋玻片，0.1％明膠包被后，接種細(xì)胞后培養(yǎng)。待蓋玻片上細(xì)胞融合后將DiI-ac-LDL以4μg/ml的濃度加入選定的培養(yǎng)孔內(nèi)，在37℃、5％CO2下孵育4h。然后吸取培養(yǎng)液，多聚甲醛固定后，以10μg/ml的濃度加入U(xiǎn)EA-FITC，37℃下孵育1h。吸取培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗2～3次。

5、 1.5基因差異表達(dá)微陣列分析標(biāo)本為經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增至第四代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后24天的細(xì)胞。提取RNA，RT-PCR合成擴(kuò)增cDNA，用熒光標(biāo)記后，與芯片上已點(diǎn)樣的寡聚核苷酸雜交，洗片后，讀取芯片上陣列的熒光信號(hào)值，兩種細(xì)胞間，誘導(dǎo)前后同一基因的信號(hào)值比為2倍以上，即為差異表達(dá)基因。 2.結(jié)果1.1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小時(shí)的培養(yǎng)，貼壁粘附在培養(yǎng)塑料培養(yǎng)瓶，換液棄未貼壁細(xì)胞，

6、繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，12天后細(xì)胞融合。消化傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，約5～7天細(xì)胞即融合，可消化傳代。培養(yǎng)擴(kuò)增到第四代后時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)倍增穩(wěn)定，開(kāi)始誘導(dǎo)分化。 1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)分化后，分別于第0天、14天和24天用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表型，結(jié)果如下表：┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃0天14天24天┃┣━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┫┃CD34┃6.23％┃4.12

7、％┃57.37％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD45┃5.79％┃4.40％┃33.85％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD54┃37.54％┃24.54％┃┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD106┃24.85％┃11.33％┃57.93％┃┃┃┃┃┃┣━━━━━━━━┻━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃3┃┃┃┗━━━━━━━━━━

8、━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┛*數(shù)值為表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率2.2ac-LDL攝取和UEA結(jié)合試驗(yàn)誘導(dǎo)分化24天后大部分細(xì)胞可攝取ac-LDL，并可結(jié)合UEA。 2.3入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后差異表達(dá)基因在選定的7267個(gè)基因中，差異表達(dá)的基因814個(gè)，新表達(dá)和表達(dá)增加信號(hào)值比率在8倍以上的基因72個(gè)，有多種編碼粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)蛋白和受體基因等。 3.討論骨髓中至少有兩類干

9、細(xì)胞，即造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。與造血干細(xì)胞不同，間充質(zhì)干細(xì)胞缺少特異性細(xì)胞表面抗原，常利用其粘附能力即貼壁法分離。在胎胚發(fā)育過(guò)程中，造血過(guò)程和內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育是非常相似的過(guò)程，導(dǎo)致人們提出設(shè)想，即這兩個(gè)細(xì)胞系可能起源于共同祖先，即成血液血管細(xì)胞(angioblasts)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞，可分化為骨、軟骨、脂肪細(xì)胞、造血支持間質(zhì)和骨骼肌，也可以誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺及消化道的上皮細(xì)胞，表明骨髓間充質(zhì)細(xì)胞具

10、有可塑性。 已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。Quirici等從骨髓中分離出AC133+細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，用VEGF誘導(dǎo)分化，部分細(xì)胞由圓形逐漸出現(xiàn)突起，呈紡錘狀鵝卵石樣排列，并呈內(nèi)皮細(xì)胞表型。Gehling等在腫瘤患者的白細(xì)胞去除術(shù)中的白細(xì)胞中分離出AC133+細(xì)胞，亦可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。說(shuō)明骨髓中存在可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞(祖細(xì)胞)。Reys等在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分選出多

11、潛能成體祖細(xì)胞4┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┓┃vWF┃18.36％┃40.06％┃70.95％┃┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━┫┃KDR┃6.27％┃1.69％┃43.67％┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━┫┃HLA-DR┃11.01％┃10.05％┃26.98％┃┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┛(MAPCs)也可誘導(dǎo)分化為具有內(nèi)皮細(xì)胞表型

12、的細(xì)胞。這些細(xì)胞在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中稀少，培養(yǎng)擴(kuò)增困難。本實(shí)驗(yàn)探索了用VEGF直接誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的可行性。 在加入VEGF誘導(dǎo)后24天，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，細(xì)胞的CD34、CD45、KDR表達(dá)變?yōu)殛?yáng)性，而CD54、CD106、vWF、HLA-DR表達(dá)量明顯增加。大部分細(xì)胞可攝取ac-LDL，并可結(jié)合UEA，提示細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的表型。這種誘導(dǎo)分化成的具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上變化不大，仍呈梭形或多角形，