人骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究及基因差異表達的微陣列分析.pdf

1、人骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究及差異表達基因的微陣列分析 骨髓間充質(zhì)干細胞是多能干細胞，已有實驗證明在體內(nèi)和體外細胞因子作用下，可分化為骨、軟骨和脂肪細胞，在體內(nèi)參與組織更新、損傷的修復(fù)和重建。本研究探討人骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞的可能性。 1.材料和方法1.1人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)人骨髓標本來源于39歲男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常規(guī)方法，抽取骨髓液5ml。肝素抗凝。DMEM+F12

2、培養(yǎng)液稀釋后，用人淋巴細胞分離液Ficoll(比重為1.077)密度梯度離心法，分離出單個核細胞。用DMEM+F12洗滌后，加入DMEM+F12與MCBD的混合培養(yǎng)液(3：2，V/V)，并加入10％胎牛血清(FCS)、2ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、10ng/ml表皮生長因子(EGF)、10ng/ml胰島素樣生長因子(IGF)和雙抗。24小時后，吸取培養(yǎng)液，連同未貼壁細胞棄去。貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每四天更換半量的培養(yǎng)液，1

3、2天后細胞融合時，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液消化后，細胞傳代，每天觀察生長情況。 1.2.誘導(dǎo)分化細胞傳至第四代后，在培養(yǎng)液中加量bFGF至10ng/ml，加10ng/mlVEGF培養(yǎng)，每四天半量換液，定期觀察細胞生長形態(tài)，于第0、14、24天分析細胞的表型和功能。 1.3流式細胞分析細胞收集后，用多聚甲醛固定后用流式細胞分析儀，分析CD34、CD45、CD54、CD106、HLA-DR、vWF及KD

4、R的表達情況。 1.4ac-LDL攝取和UEA結(jié)合試驗細胞培養(yǎng)到實驗設(shè)計的時間，在消化傳代時，在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放入適當(dāng)大小蓋玻片，0.1％明膠包被后，接種細胞后培養(yǎng)。待蓋玻片上細胞融合后將DiI-ac-LDL以4μg/ml的濃度加入選定的培養(yǎng)孔內(nèi)，在37℃、5％CO2下孵育4h。然后吸取培養(yǎng)液，多聚甲醛固定后，以10μg/ml的濃度加入UEA-FITC，37℃下孵育1h。吸取培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗2～3次。

5、 1.5基因差異表達微陣列分析標本為經(jīng)培養(yǎng)擴增至第四代的人骨髓間充質(zhì)干細胞和向血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化后24天的細胞。提取RNA，RT-PCR合成擴增cDNA，用熒光標記后，與芯片上已點樣的寡聚核苷酸雜交，洗片后，讀取芯片上陣列的熒光信號值，兩種細胞間，誘導(dǎo)前后同一基因的信號值比為2倍以上，即為差異表達基因。 2.結(jié)果1.1人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，貼壁粘附在培養(yǎng)塑料培養(yǎng)瓶，換液棄未貼壁細胞，

6、繼續(xù)培養(yǎng)，細胞呈克隆樣生長，12天后細胞融合。消化傳代后細胞生長速度加快，約5～7天細胞即融合，可消化傳代。培養(yǎng)擴增到第四代后時，細胞生長倍增穩(wěn)定，開始誘導(dǎo)分化。 1.2流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)分化后，分別于第0天、14天和24天用流式細胞術(shù)檢測細胞的表型，結(jié)果如下表：┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃0天14天24天┃┣━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┫┃CD34┃6.23％┃4.12

7、％┃57.37％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD45┃5.79％┃4.40％┃33.85％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD54┃37.54％┃24.54％┃┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD106┃24.85％┃11.33％┃57.93％┃┃┃┃┃┃┣━━━━━━━━┻━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃3┃┃┃┗━━━━━━━━━━

8、━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┛*數(shù)值為表達陽性細胞的百分率2.2ac-LDL攝取和UEA結(jié)合試驗誘導(dǎo)分化24天后大部分細胞可攝取ac-LDL，并可結(jié)合UEA。 2.3入骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化后差異表達基因在選定的7267個基因中，差異表達的基因814個，新表達和表達增加信號值比率在8倍以上的基因72個，有多種編碼粘附分子和細胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮細胞功能相關(guān)蛋白和受體基因等。 3.討論骨髓中至少有兩類干

9、細胞，即造血干細胞和間充質(zhì)干細胞。與造血干細胞不同，間充質(zhì)干細胞缺少特異性細胞表面抗原，常利用其粘附能力即貼壁法分離。在胎胚發(fā)育過程中，造血過程和內(nèi)皮細胞的發(fā)育是非常相似的過程，導(dǎo)致人們提出設(shè)想，即這兩個細胞系可能起源于共同祖先，即成血液血管細胞(angioblasts)。 骨髓間充質(zhì)干細胞是多能干細胞，可分化為骨、軟骨、脂肪細胞、造血支持間質(zhì)和骨骼肌，也可以誘導(dǎo)分化為肝細胞、心肌細胞、肺及消化道的上皮細胞，表明骨髓間充質(zhì)細胞具

10、有可塑性。 已有體內(nèi)實驗和動物細胞的體外培養(yǎng)實驗證明，骨髓間充質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞。Quirici等從骨髓中分離出AC133+細胞，培養(yǎng)擴增，用VEGF誘導(dǎo)分化，部分細胞由圓形逐漸出現(xiàn)突起，呈紡錘狀鵝卵石樣排列，并呈內(nèi)皮細胞表型。Gehling等在腫瘤患者的白細胞去除術(shù)中的白細胞中分離出AC133+細胞，亦可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞。說明骨髓中存在可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞的干細胞(祖細胞)。Reys等在人骨髓間充質(zhì)干細胞中分選出多

11、潛能成體祖細胞4┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┓┃vWF┃18.36％┃40.06％┃70.95％┃┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━┫┃KDR┃6.27％┃1.69％┃43.67％┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━┫┃HLA-DR┃11.01％┃10.05％┃26.98％┃┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┛(MAPCs)也可誘導(dǎo)分化為具有內(nèi)皮細胞表型

12、的細胞。這些細胞在骨髓間充質(zhì)干細胞中稀少，培養(yǎng)擴增困難。本實驗探索了用VEGF直接誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮細胞的可行性。 在加入VEGF誘導(dǎo)后24天，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，細胞的CD34、CD45、KDR表達變?yōu)殛栃?，而CD54、CD106、vWF、HLA-DR表達量明顯增加。大部分細胞可攝取ac-LDL，并可結(jié)合UEA，提示細胞具有內(nèi)皮細胞的表型。這種誘導(dǎo)分化成的具有內(nèi)皮細胞表型的細胞在形態(tài)學(xué)上變化不大，仍呈梭形或多角形，