乳中IgA和IgM含量的變化及其影響因素的機理研究.pdf

1、本試驗由四部分組成，主要研究了初乳、常乳和免疫乳血清和乳清中各免疫球蛋白含量的變化規(guī)律及其乳清中主要蛋白質的SDS-PAGE分析，并研究了牛乳中IeA和IgM濃度的影響因素，包括奶牛胎次、泌乳階段、產奶量、體細胞評分(SCS)以及奶牛plgR基因5'側翼區(qū)的SNP。以小鼠為試驗動物模型來探討奶牛乳腺中IgA和IgM合成轉運的機理，研究了小鼠免疫刺激后plgR基因的表達量及與特異性lgA含量的相關性。具體研究結果如下： 試驗一：采

2、用埋植抗原緩釋劑ARD這一種新型的免疫乳生產技術。選取2胎牛20頭，按照泌乳天數(shù)、產奶量相近的原則隨機分成2組，每組10頭，其中10頭用于埋植ARD(試驗組)，其余為對照(對照組)。采集每頭牛的乳樣和血樣。同時采集奶牛產后0-7 d的初乳乳樣(n=20)和產后1 d和5 d的血樣。采用夾心ELISA測定血清和乳清中的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的含量。結果表明免疫組奶牛的血清和乳清中的各免疫球蛋白的含量均高于對照組。其中乳清中IgG

3、的含量在9 d、17 d和32 d分別達到最高峰，這與ARD在埋植后0 d、14 d和28 d釋放相一致。相反，乳清中的IgA和IgM的含量沒有表現(xiàn)出相同的規(guī)律。初乳牛1d的血清中IgM的含量顯著高于5 d的含量(p<0.05)，而IgG和IgA的含量無顯著差異。初乳乳清的各免疫球蛋白含量隨著泌乳天數(shù)的增加而迅速下降，直至維持在較低的水平。SDS-PAGE結果表明，從電泳圖譜上可以清晰的看見5個條帶，自上而下依次是乳鐵蛋白、牛血清白蛋白

4、、IgG重鏈、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中32 d的免疫乳和0-3 d的初乳可以看到IgG的輕鏈，其它樣品IgG輕鏈條帶較弱。0-7d初乳各乳清蛋白的相對含量隨著泌乳天數(shù)增加而逐漸下降，在0-5d內差異顯著(p<0.05)，直至維持在較低水平。免疫乳15 d和32 d各乳清蛋白均高于常乳。 試驗二：研究了正常泌乳奶牛中IgA和IeM的濃度是否受奶牛胎次、泌乳階段、產奶量和牛奶體細胞評分(SCS)的影響。從1600多頭奶牛群體

5、中隨機選擇284頭奶牛采集其牛奶樣品，通過夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定其IgA和IgM的濃度。牛奶中IgA和IgM的濃度(平均數(shù)±標準差，對數(shù)形式，下同)分別為2.371±0.286和1.499±±0.383。4胎以上(含4胎)的奶牛其乳中IgA平均濃度高于1胎、2胎和3胎牛，而3胎牛和4胎牛其乳中IgM的平均濃度差異顯著(p<0.05)；IgA濃度在泌乳前期和泌乳中期較低，而IgM濃度隨著泌乳天數(shù)的增加而增加；產奶量為20-2

6、5kg和大于30 kg的奶牛其乳中IgA含量較低，但是產奶量并不影響IgM含量；牛奶中IgA和IgM含量都隨著SCS的增加而增加。相關分析和通徑分析表明，這些因素對牛奶中IgA和IgM的累積效應值分別達到了0.320和0.358。 試驗三：從NCBI上的Map Viewer數(shù)據(jù)庫下載牛plgR基因的5'側翼區(qū)的序列(Nw 174143)，長度為3.2 kb，設計4對引物進行PCR擴增，通過對25頭牛的PCR產物直接測序發(fā)現(xiàn)SNP

7、位點，采用SNP Stream標簽微列陣基因分型系統(tǒng)對189頭牛進行基因分型，將其與牛奶和血液中的IgA和IgM的含量進行關聯(lián)分析。結果表明，在基因-3128、-3072、-2834、-2348和-515位發(fā)現(xiàn)了5個SNP位點，其中SNPl和SNP2為A/G突變，SNP3、SNP4和SNP5為T/C突變。方差分析結果表明，SNP1對牛奶IgM和血液IgA含量有顯著的影響(p<0.05)，SNP3和SNP5對血液IgM含量有顯著影響(p<

8、0.05)，其它SNP位點與單倍型組合對乳及血液中IgA和IgM的含量均沒有顯著影響(p<0.05)；多重比較分析表明，SNP1位點的基因型AB個體與BB個體的牛奶IgM和血液IgA含量的最小二乘均數(shù)差異顯著(p<0.05)；SNP3和SNP5的不同基因型對血液IgM含量的最小二乘均數(shù)分別達到了顯著水平(p<0.05)。因此，從研究結果可以看出奶牛okgR基因5'側翼區(qū)的多態(tài)性影響牛奶和血液中的IgA和IgM的含量，這為進一步研究牛奶中

9、IgA和IgM分泌轉運機理提供了一定的理論依據(jù)。 試驗四：本試驗以小鼠為試驗動物來研究乳中IgA的產生轉運機理。選擇48只健康昆明小白鼠，分為A、B、C、D組，分別于分娩后第4d注射以下四種疫苗：滅菌生理鹽水、Lipase+滅菌生理鹽水、空ISCOM和Lipase+ISCOM，每組注射12只，并于分娩后8 d和12 d(即注射后4 d和8 d)采集各小鼠乳樣、血樣和乳腺組織，用間接ELISA法測定乳樣和血漿中的特異性IgA含量，

10、用Real TimePCR檢測小鼠乳腺中pIgR基因的相對表達量。結果表明，血漿中特異性IgA的含量差異不顯著，而B組和D組中分娩后12 d的乳中特異性IgA含量顯著高于8 d乳中的特異性IgA含量(p<0.05)，Real Time PCR相對定量結果也表明，B組和D組在分娩后12 d的乳腺中pIgR基因的表達量上升。因此，乳腺中pIgR基因表達量增加可以提高乳中特異性IgA的水平，這表明pIgR參與介導IgA跨膜分泌進入乳中，pIg