線粒體DNA T3394C突變對(duì)Leber遺傳性視神經(jīng)病變影響的研究.pdf

1、第一部分 Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者篩查及資料收集 目的： 1．在全國(guó)范圍內(nèi)收集視神經(jīng)病變家系，建立臨床資料和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫。并收集194個(gè)無親緣關(guān)系的正常人作為對(duì)照。 2．在收集的視神經(jīng)病變家系及正常對(duì)照者中篩查與Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）相關(guān)的線粒體DNA（mtDNA）三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)（G3460A、G11778A、

2、T14484C），了解中國(guó)人群的突變頻譜。 方法： 1．對(duì)收集的視神經(jīng)病變家系采集血樣，了解家系情況，并對(duì)試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行詳細(xì)的眼科臨床檢查，建立臨床和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫。 2．對(duì)采集的血樣提取基因組DNA，并設(shè)計(jì)三對(duì)引物對(duì)包含三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序。 3．使用各種生物軟件（DNAStar、Chromas、Clustal X）分析測(cè)序結(jié)果，找出所有的多態(tài)性位點(diǎn)和突變位點(diǎn)，分析其對(duì)L

3、HON表型表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．本課題組共收集到視神經(jīng)病變家系690個(gè)，其中攜帶LHON三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)的家系302個(gè)，包括G11778A突變家系255個(gè)、G3460A突變家系9個(gè)、T14484C突變家系38個(gè)。 2．對(duì)包含三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的片段篩查發(fā)現(xiàn)攜帶繼發(fā)突變位點(diǎn)（G3316A、T3394C、C3497T、G3635A、G3733A、G11696A及A14693G）的家系共102個(gè)。 3．在194例

4、正常對(duì)照者中攜帶T3394C突變位點(diǎn)的有2例。 結(jié)論： 1．中國(guó)人群中Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的原發(fā)突變發(fā)病頻譜與白種人有所差異，G11778A突變比例較高，G3460A和T14484C突變所占比例較低。 2．G11778A合并T3394C的家系7個(gè)，T3394C不合并原發(fā)突變位點(diǎn)的家系9個(gè)，為研究T3394C突變對(duì)LHON表型表達(dá)的影響提供遺傳資料基礎(chǔ)。 第二部分線粒體 DNA T3394C突變可

5、能影響Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的表型表達(dá) 目的： 1．了解三個(gè)攜帶mtDNA T3394C突變但不攜帶原發(fā)突變位點(diǎn)的LHON家系的臨床表型、外顯率和表現(xiàn)度，分析T3394C突變對(duì)LHON表型表達(dá)的影響。 2．了解兩個(gè)攜帶mtDNA T3394C和G11778A雙突變位點(diǎn)的LHON家系的臨床表型、外顯率和表現(xiàn)度，探討T3394C突變?cè)跀y帶G11778A突變位點(diǎn)的LHON家系表型表達(dá)中的作用。 3．分析

6、線粒體背景、核修飾基因、環(huán)境因素（吸煙、飲酒和心理因素等）對(duì)中國(guó)LHON家系外顯率和表現(xiàn)度的影響。 方法： 1．對(duì)家系先證者及母系成員進(jìn)行詳細(xì)的眼科檢查，詳細(xì)詢問并記錄家族史。 2．以家系先證者基因組DNA為模板，使用24對(duì)有部分重疊的引物對(duì)先證者mtDNA全序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序。 3．使用各種生物軟件（DNAStar、Chromas、Clustal X）分析測(cè)序結(jié)果，找出所有的多態(tài)性位點(diǎn)和突變

7、位點(diǎn)，分析其對(duì)功能的影響。 結(jié)果： 1．五個(gè)家系都具有典型的LHON臨床表現(xiàn)，WZ98、WZ99和WZ100家系中都僅有一個(gè)成員發(fā)病，外顯率分別為5．9％、10％和8．3％，發(fā)病年齡分別為14歲、21歲和14歲，視力損傷程度從輕度、中度到重度不等。WZ102和WZ103家系中LHON的外顯率為56％和38％，家系平均發(fā)病年齡分別為19歲和17歲，男女發(fā)病比例為1：1．5和3：0。 2．對(duì)先證者線粒體基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)

8、這五個(gè)序列都存在許多mtDNA變異位點(diǎn)，WZ98、WZ99和WZ100家系未檢測(cè)到G11778A、G3460A和T14484C三個(gè)常見的突變位點(diǎn)，但先證者和母系成員均存在ND1基因T3394C位點(diǎn)同質(zhì)性突變。WZ102和WZ103家系同時(shí)存在G11778A原發(fā)突變位點(diǎn)及T3394C突變位點(diǎn)。 3．線粒體單體型分析這五個(gè)mtDNA序列分別屬于亞洲單體型D4b2、M9a、M9a3M9a和M9a。 結(jié)論： 1．三個(gè)攜帶

9、mtDNA T3394C突變但不攜帶原發(fā)突變位點(diǎn)的LHON家系中只有一個(gè)成員發(fā)病，在194例正常對(duì)照者中存在2例攜帶T3394C突變，這種低外顯率和在正常對(duì)照者出現(xiàn)說明T3394C突變本身不足導(dǎo)致LHON的發(fā)生。 2．兩個(gè)攜帶mtDNA T3394C和G11778A雙突變位點(diǎn)的LHON家系外顯率較高，分別為56％和38％，G11778A突變是其致病的主要因素。T3394C突變位于ND1基因進(jìn)化保守區(qū)，它使ND1亞單位中第30位極